Bcl-2-zależne utlenianie pirogronianowej dehydrogenazy-E2, pierwotnego autoantygenu żółciowej dróg żółciowych, podczas apoptozy ad 5

Przeciwnie, barwienie COX-1 w apoptotycznej HeLa było łatwe do wykrycia i podobne do tego w apoptotycznych NRC. Aby lepiej zrozumieć tę różnicę w barwieniu PDC-E2 w apoptotycznych komórkach HeLa w porównaniu z apoptotycznymi NRC, zbadaliśmy zarówno dodatkowe typy komórek, jak i inne bodźce apoptotyczne. Po traktowaniu UV-B stwierdzono silne zabarwienie PDC-E2 w apoptotycznych HSG (fig. 4j) jak w NRC, natomiast utrata barwienia PDC-E2 w apoptotycznych komórkach T Jurkat (Figura 4) jak w komórkach HeLa. HSG badano, ponieważ uszkodzenie gruczołów ślinowych w PBC jest dość powszechne. Utratę barwienia PDC-E2 w komórkach apoptotycznych obserwowano również po traktowaniu staurosporyną komórkami HeLa (Figura 4n, komórki apoptotyczne są znakowane gwiazdami), komórki Caco-2 (dane nie przedstawione) i komórki T Jurkat (dane nie przedstawione). Przeciwnie, traktowanie staurosporyną ani NRC (Figura 4p), ani HSG (dane nie pokazane) prowadziło do utraty barwienia PDC-E2 w apoptotycznych NRC lub HSG. Podobnie traktowanie granulkami CTL powodowało utratę barwienia PDC-E2 w apoptotycznych komórkach HeLa, ale nie w apoptotycznych NRC (dane nie przedstawione). Dla każdego bodźca utrzymywanie się wybarwienia PDC-E2 w komórkach apoptotycznych zależało od typu komórki przechodzącej apoptozę. Figura 4 Odtworzenie barwienia PDC-E2 przez surowice pacjentów PBC w komórkach apoptotycznych jest zależne od komórek i niezależne od bodźca stosowanego do wywołania apoptozy. Zarówno komórki kontrolne, jak i komórki traktowane UV-B lub staurosporyną (STS) w celu wywołania apoptozy badano za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej. Komórki wybarwiono DAPI (ayh) w celu rozróżnienia komórek apoptotycznych (komórki znakowane gwiazdami) od komórek nieapoptotycznych (komórki niewyznakowane). Po traktowaniu UV-B, surowice PBC pacjenta barwienia PDC-E2 wykryto w apoptotycznych HSG (j), ale nie w apoptotycznych komórkach T Jurkat (1). Podczas indukcji apoptozy za pomocą STS, immunoreaktywność PDC-E2 ponownie była niewykrywalna w apoptotycznym HeLa (n), podczas gdy utrzymywała się w apoptotycznych NRC (p) i była niewykrywalna w apoptotycznej HeLa (n). Bary, 20 m. Wszystkie typy komórek barwiono niezależnie dwiema różnymi surowicami monoswoistymi PDC-E2 co najmniej trzy razy z podobnymi wynikami za każdym razem. Wyświetlane są reprezentatywne obrazy. Utrata autoprzeciwciał rozpoznania PDC-E2 po apoptozie wynika z glutationu jego grupy (grup) sulfhydrylowej. Możliwe wyjaśnienia utraty wybarwienia PDC-E2 w niektórych typach komórek po apoptozie obejmują: (a) wyciek PDC-E2 z mitochondriów, (b) degradację PDC-E2 i (c) utratę tylko z Epitop PDC-E2 rozpoznawany przez autoprzeciwciała pacjenta PBC. W celu wykrycia wycieku PDC-E2 do cytozolu po apoptozie indukowanej UV-Bp, frakcje subkomórkowe przygotowano z kontrolnych i apoptotycznych komórek HeLa. Wysoki stopień cięcia PARP wykryty we frakcji jądrowej komórek traktowanych UV-B (Fig. 5, ścieżka 2) potwierdził, że apoptozę indukowano w wysokim odsetku komórek. W lizacie apoptotycznej frakcji cytozolowej wykryto mały PDC-E2 (Figura 5, ścieżka 4). Dodatkowo, było równoważne immunoblottingu PDC-E2 w apoptotycznym lizacie mitochondrialnym w porównaniu z kontrolnym lizatem mitochondrialnym (Figura 5, ścieżki 6 i 5, odpowiednio). Ponieważ rozpoznawanie autoprzeciwciał przez PDC-E2 przez immunoblotting (Figura 2) było równoważne w lizatach komórek kontrolnych i apoptotycznych, mało prawdopodobne jest wyjaśnienie degradacji PDC-E2. Utraty tylko epitopu PDC-E2 rozpoznawanego przez autoprzeciwciała pacjentów PBC nie można w podobny sposób wykluczyć przez wyniki immunoblottingu, ponieważ utrata epitopu może być przejściowa i zależna od lokalnego środowiska mitochondrialnego. Figura 5PDC-E2 nie wycieka z mitochondriów podczas apoptozy. Zredukowane lizaty subkomórkowych frakcji komórek kontrolnych (C) i promieniowanych UV-Bp, apoptotycznych (A) HeLa poddano immunoblottingowi z surowicami SLE i PBC pacjentów monospecyficznych dla PARP (ścieżki i 2) i PDC-E2 (ścieżki 3. 6) , odpowiednio. W kontrolnej frakcji jądrowej (Nucl) dominowała nienaruszona PARP, podczas gdy jej fragment kaspazy był dominującą formą wykrytą w apoptotycznej frakcji jądrowej (ścieżka 2), potwierdzając indukcję wysokiego stopnia aktywności kaspazy w UV-B traktowane komórki. PDC-E2 został silnie wykryty zarówno we frakcjach kontrolnych, jak i apoptotycznych mitochondrialnych (Mito) (ścieżki 5 i 6), ale nie w żadnej cytozolowej (Cyto) frakcji (ścieżki 3 i 4). Markery wielkości molekularnej (Mr × 10. 3) są pokazane po lewej stronie. Eksperyment powtórzono dwukrotnie z identycznymi wynikami. Przedstawiono reprezentatywny blot. Poprzednie badania PDC oczyszczonego z próbek tkanek wykazały, że epitop PDC-E2 rozpoznawany przez autoprzeciwciała pacjenta PBC jest wrażliwy na potencjał redoks sulfhydrylowy preparatu (36)
[patrz też: krem pod oczy z peptydami, syrop tymiankowy złożony, zss kolbuszowa dolna ]
[podobne: wydłużenie etapu edukacyjnego uzasadnienie, uzasadnienie wydłużenia etapu edukacyjnego, zss kolbuszowa dolna ]