Bcl-2-zależne utlenianie pirogronianowej dehydrogenazy-E2, pierwotnego autoantygenu żółciowej dróg żółciowych, podczas apoptozy ad 6

Intensywność immunoblottingu PDC-E2 przez surowicę odpornościową PBC korelowała ze stężeniem sulfhydrylowego środka redukującego w buforze próbki dodanym do oczyszczonego PDC przed SDS-PAGE, co sugeruje, że autoprzeciwciała pacjentów PBC preferencyjnie rozpoznają PDC-E2 ze zredukowanymi grupami sulfhydrylowymi. Przypadkowo wykazano, że potencjał komórkowy redoks podczas apoptozy zmniejsza się podczas apoptozy w niektórych typach komórek (37) ze względu na zwiększone wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS), szczególnie w mitochondriach. Wykazaliśmy wcześniej, że leczenie cholangiocytów za pomocą BSO, inhibitora syntetazy glutationowej, obniża cholangiocyty glutationu (38), zwiększając ich wrażliwość na działanie ROS. W celu określenia, czy swoista dla komórek typowa różnica w barwieniu PDC-E2 po apoptozie była spowodowana różnicami w komórkowym potencjale redoks-sulfhydrylowego, a następnie wytwarzaniem ROS podczas apoptozy, NRC były wstępnie traktowane BSO przez 24 godziny przed wywołaniem apoptozy. Komórki HSG i HeLa były podobnie traktowane. Wstępne traktowanie każdego rodzaju komórek za pomocą BSO zmniejszyło całkowity poziom glutationu większy niż 90% w porównaniu z komórkami nietraktowanymi (Tabela 1) i samo w sobie nie indukowało apoptozy. Nie było różnicy w barwieniu PDC-E2 apoptotycznych NRC i komórek HSG z lub bez traktowania BSO przed napromieniowaniem UV-B (dane nie pokazane). Niespodziewanie, barwienie PDC-E2 utrzymywało się w apoptotycznych komórkach HeLa po napromieniowaniu UV-B komórek wstępnie traktowanych BSO (Figura 6d). Tak jak poprzednio, przy braku wstępnego leczenia BSO, wybarwienie PDC-E2 było niewykrywalne w apoptotycznych komórkach HeLa (Figura 6c, komórki apoptotyczne są oznaczone gwiazdką). Preinkubacja surowic pacjenta PBC z oczyszczonym PDC hamowała barwienie PDC-E2 w apoptotycznych komórkach HeLa traktowanych wcześniej BSO (dane nie pokazane). Ubytek całkowitego komórkowego glutationu z BSO zapobiegał utracie barwienia PDC-E2 po apoptozie komórek HeLa. Figura 6 Wydalanie komórkowego glutationu przez traktowanie BSO przed napromieniowaniem UV-B zapobiega utracie barwienia PDC-E2 w apoptotycznych komórkach HeLa. Napromieniowane komórki UV-Bp barwiono DAPI (aib) w celu odróżnienia komórek nieapoptotycznych od apoptotycznych i monospecyficznej surowicy pacjenta PBC przeciwko PDC-E2 (cid). Komórki apoptotyczne są oznaczone gwiazdkami. Barwienie analizowano za pomocą konfokalnej, immunofluorescencyjnej mikroskopii. W przypadku braku wstępnego traktowania BSO, barwienie PDC-E2 ponownie nie wykryto w apoptotycznych komórkach HeLa po napromieniowaniu UV-B (c). Jednakże, barwienie PDC-E2 utrzymywało się w apoptotycznych komórkach HeLa traktowanych uprzednio BSO przed napromienianiem UV-B (d). Bary, 20 m. Każdy eksperyment powtórzono co najmniej trzy razy z identycznymi wynikami. Wyświetlane są reprezentatywne obrazy. Tabela Komórkowe poziomy glutationu w obecności i nieobecności BSO Wynik ten sugerował rolę glutationu (GSH) w utlenianiu grup sulfhydrylowych PDC-E2 prowadząc do utraty barwienia PDC-E2 w apoptotycznych komórkach HeLa. Zgłaszano zwiększone stężenia koniugatów białko-SSG w komórkach apoptotycznych (24). Aby określić, czy utleniony glutation (GSSG) bezpośrednio utlenia grupy sulfhydrylowe PDC-E2, aby spowodować utratę epitopu PDC-E2 rozpoznawanego przez autoprzeciwciała pacjenta PBC, lizaty detergentowe apoptotycznych NRC potraktowano DTT (5 mM) i SDS (2%), a następnie gotowane w celu zdezaktywowania białek lizatu przed dodaniem GSSG (10 mM) i poddaniem PAGE. Po przeniesieniu białek do nitrocelulozy, immunoblotting PDC-E2 przez autoprzeciwciała pacjenta PBC był nieobecny w lizacie, do którego dodano GSSG (Figura 7a, ścieżka 2). W przypadku braku GSSG (linia 1) lub w obecności nadmiaru DTT (25 mM) w stosunku do GSSG (10 mM) (linia 3), wykryto PDC-E2. Glutatiolation PDC-E2 w lizacie apoptotycznym odwracalnie hamował jego rozpoznawanie przez autoprzeciwciała pacjenta PBC. Figura 7 Bezpośrednie utlenianie PDC-E2 przez utleniony glutation znosi rozpoznawanie PDC-E2 przez surowice pacjenta PBC. (a) Lizat apoptotyczny NRC potraktowano SDS, gotowano, a następnie traktowano sekwencyjnie 5 mM DTT, 10 mM GSSG i 25 mM DTT. Silną blotting PDC-E2 wykrywano w lizacie traktowanym 5 mM DTT (linia 1). Blotting PDC-E2 był nieobecny po dodaniu GSSG do lizatu traktowanego DTT (ścieżka 2), ale następnie leczenie dodatkową DTT przywróciło wykrywanie PDC-E2 (linia 3). (b) Różnicę między rozpoznaniem utlenionych względem obniżonych PDC-E2 przez autoprzeciwciała pacjentów PBC oszacowano ilościowo za pomocą lizatu immunoblottingu traktowanego 10 mM GSSG w porównaniu z 5 mM DTT. Przedstawiono reprezentatywny blot. (c) Stan utleniania PDC-E2 nie wpływa znacząco na jego przeniesienie na nitrocelulozę
[patrz też: syrop tymiankowy złożony, szkoła rodzenia madalińskiego, przychodnia ożarów mazowiecki ]
[przypisy: instytucje zajmujące się pomocą dla młodzieży z problemami rodzinnymi, niepokój manipulacyjny, wirusowe zapalenie krtani ]