Bcl-2-zależne utlenianie pirogronianowej dehydrogenazy-E2, pierwotnego autoantygenu żółciowej dróg żółciowych, podczas apoptozy ad 7

PDC-E2 poddano immunoprecypitacji przy użyciu surowic pacjenta PBC z lizatu komórek HeLa inkubowanych z [35S] -metioniną do białek znakujących. Połowę immunoprecypitatu potraktowano DTT, a drugą połowę GSSG przed wykonaniem SDS-PAGE. Autoradiogram wykonany po przeniesieniu do nitrocelulozy wykazał, że przeniesiono podobne ilości zarówno zredukowanego, jak i utlenionego PDC-E2. Wyniki przedstawiają dwa różne surowice pacjenta PBC (ścieżki i 2). (d) Poziom ekspresji Bcl-2 koreluje z utrzymaniem barwienia PDC-E2 po apoptozie. Osiemdziesiąt mikrogramów białka lizatu zostało załadowane na ścieżkę i poddane immunoblottingowi za pomocą mAb swoistego dla ludzkiego Bcl-2. Wysokie poziomy Bcl-2 wykryto tylko w transfekowanych Bcl-2 (3 transferach HeLa (linia 1) i HSG (linia 2). W doświadczeniach z miareczkowaniem z użyciem surowicy od pięciu różnych pacjentów z PBC różnica w rozpoznawaniu autoprzeciwciał PDC-E2 w traktowanych GSSG w porównaniu z traktowanymi DTT lizatami apoptotycznych NRC wahała się od 100 do 1000 razy (Figura 7b i dane nie przedstawione) na obliczone rozcieńczenie autoprzeciwciał, przy którym OD pasma PDC-E2 wynosiłoby 1,5 (środek skali OD). To słabe rozpoznanie autoprzeciwciał PDC-E2 w lizatach traktowanych GSSG nie było spowodowane nieskutecznym przeniesieniem glutatiolowanego PDC-E2 do nitrocelulozy, jak pokazano poniżej. PDC-E2 był utleniony (traktowany GSSG) lub zredukowany (traktowany DTT) po immunoprecypitacji z lizatów komórek HeLa znakowanych [35S] -metioniną z surowicami odpornościowymi od pacjentów z PBC. Po SDS-PAGE zarówno utleniony, jak i zredukowany znakowany [35S] -metioniną PDC-E2 przeniesiono na nitrocelulozę w równych ilościach, co oceniono autoradiografią (Figura 7c). Wysoki poziom ekspresji Bcl-2 chroni epitop PDC-E2 rozpoznawany przez autoprzeciwciała pacjenta PBC w komórkach apoptotycznych. Tworzenie się koniugatów białka. SSG podczas apoptozy jest regulowane przez poziom ekspresji Bcl-2, białka antyapoptotycznego o właściwościach przeciwutleniających (24). Ludzkie cholangiocyty (25, 26) i NRC (39) są niezwykłe, ponieważ konstytutywnie wyrażają wysokie poziomy Bcl-2. Wysokie poziomy Bcl-2 wykryto również w komórkach HSG (Figura 7d, ścieżka 2), ale nie w komórkach T HeLa lub Jurkat (Figura 7d, ścieżki 3 i 4, odpowiednio). Poziom ekspresji Bcl-2 w każdym typie komórek korelował z utrzymaniem barwienia PDC-E2 po apoptozie. Aby bezpośrednio określić, czy poziom ekspresji Bcl-2 wpływa na glutatiolowanie PDC-E2 w komórkach apoptotycznych, badano komórki HeLa eksprymujące wysokie poziomy Bcl-2 (figura 7d, ścieżka 1) po transfekcji cDNA Bcl-2. Napromieniowane promieniowaniem UV-Bp komórki HeLa transfekowane Bcl-2P barwiono surowicami PBC pacjenta monospecyficznymi dla PDC-E2. Aby osiągnąć równoważny zakres apoptozy, czas inkubacji po napromieniowaniu UV-B był podwojony w komórkach HeLa transfekowanych Bcl-2 (3 w porównaniu z komórkami HeLa typu dzikiego (WT). Intensywne punkcikowe, okołojądrowe barwienie wykryto w apoptotycznych komórkach HeLa transfekowanych Bcl-2 (Fig. 8h, komórki apoptotyczne są znakowane gwiazdą), w przeciwieństwie do apoptotycznych komórek WT HeLa (Figura 3d). Epitop (e) PDC-E2 rozpoznawany przez autoprzeciwciała pacjenta PBC utrzymywały się po apoptozie komórek HeLa transfekowanych Bcl-2 (3, ale nie komórkach WT HeLa. Zgodnie z tym odkryciem poziomy glutationu są o 50% wyższe w komórkach HeLa transfekowanych Bcl-2a nienapromienionych niż w komórkach HeLa WT i tylko dramatycznie zmniejszają się w komórkach HeLa WT, a nie w komórkach HeLa transfekowanych Bcl-2 (3, po naświetlaniu UV-B (Tabela 1). W celu wzmocnienia korelacji między komórkowymi poziomami Bcl-2 i zachowaniem epitopu PDC-E2 rozpoznawanego przez autoprzeciwciała pacjenta PBC po apoptozie badano także pierwotne fibroblasty ludzkiej skóry, o których wiadomo, że eksprymują niskie poziomy Bcl-2 (40). W apoptotycznych pierwotnych fibroblastach, wykrywanie autoprzeciwciał pacjenta PBC z PDC-E2 było nieobecne po napromieniowaniu UV-B (Figura 8j), jak zaobserwowano w liniach komórkowych wyrażających względnie niskie poziomy Bcl-2. W obu liniach komórkowych i komórkach pierwotnych utrzymywanie się epitopu PDC-E2 rozpoznawanego przez autoprzeciwciała pacjenta PBC w komórkach apoptotycznych korelowało z poziomem ekspresji Bcl-2 w tym typie komórki. Dodatkowo, barwienie PDC-E2 utrzymywało się w świeżo izolowanych, szczurzych IBDEC po apoptozie indukowanej UV-B (Figura 8), jak zaobserwowano w NDR, co sugeruje, że badania apoptozy NRC dotyczą apoptozy natywnych cholangiocytów wyściełających wewnątrzwątrobowe drzewo żółciowe. Figura 8Odjęcie PDC-E2 podczas apoptozy jest zależne od Bcl-2. Kontrolowane i napromieniowane komórki UV-B. Barwiono DAPI (a-f) w celu odróżnienia komórek nieapoptotycznych od apoptotycznych i monospecyficznej surowicy pacjenta PBC przeciwko PDC-E2 (g. L)
[przypisy: kalendarz triathlon 2015, mleko z biedronki wycofane, krem pod oczy z peptydami ]
[podobne: zdrowe odżywianie dzieci, syrop tymiankowy złożony, narodowy fundusz zdrowia w łodzi ]