Bcl-2-zależne utlenianie pirogronianowej dehydrogenazy-E2, pierwotnego autoantygenu żółciowej dróg żółciowych, podczas apoptozy ad

Utrata wybarwienia PDC-E2 wśród różnych typów komórek korelowała z poziomem ekspresji Bcl-2, który ma właściwości przeciwutleniające i hamuje utlenianie białka podczas śmierci komórki (22. 24). Nadekspresja Bcl-2 przez transfekcję hamowała utratę barwienia PDC-E2 w apoptotycznych komórkach HeLa. Cholangiocyty in vivo wykazują znacznie wyższe poziomy Bcl-2 w porównaniu z większością typów komórek (25, 26). Wyniki te sugerują, że u pacjentów z PBC apoptyczne cholangiocyty są źródłem immunogennego PDC-E2 odpowiedzialnego za przewlekłą aktywację autoreaktywnych limfocytów. Metody Sera i Ab. Po uzyskaniu świadomej zgody, surowice uzyskano od pacjentów, u których zdiagnozowano poprzednio PBC, pierwotne stwardniające zapalenie dróg żółciowych (PSC), autoimmunologiczne zapalenie wątroby (AIH) i toczeń rumieniowaty układowy (SLE) oraz od osób zdrowych. Rozpoznanie PBC zostało potwierdzone przez kryteria kliniczne i biopsję wątroby we wszystkich przypadkach. Mitotracker i mAb specyficzne dla podjednostki oksydazy cytochromu (COX-1) zakupiono od firmy Molecular Probes Inc. (Eugene, Oregon, USA). Otrzymano również mAb przeciwko ludzkiemu Bcl-2 (DAKO Inc., Glostrup, Dania). Wszystkie inne Ab. S zakupiono od Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (West Grove, Pennsylvania, USA), o ile nie zaznaczono inaczej. Hodowanie komórek i indukcja apoptozy. HeLa (27), normalne szczurze cholangiocyty (NRC) (pochodzące z cholangiocytów izolowanych od prawidłowego szczura z podwiązanym przewodem żółciowym) (28), fibroblasty ludzkiej skóry, Caco-2 (29) i komórki Jurkat T (30) pasażowano w określonych pożywkach uzupełnionych inaktywowaną ciepłem surowicą cielęcą, jak opisano poprzednio, stosując standardowe procedury hodowli tkankowej. Ludzkie komórki nabłonkowe gruczołu ślinowego (HSG) (pierwotnie od K. Shirasuna i uprzejmie dostarczone przez Bruce Baum, National Institute of Dental and Cranio-facial Research, NIH, Bethesda, Maryland, USA) (31) zostały pasażowane w tym samym medium jako komórki HeLa: DMEM uzupełniony penicyliną (100 U / ml), streptomycyną (100 ug / ml) i L-glutaminą (2 mM), a także 10% dezaktywowaną termicznie surowicą cielęcą. Genetycynę (200 .g / ml) i higromycynę B (100 .g / ml) dodano do tej pożywki w celu przejścia komórek HeLa transfekowanych Bcl-2 (hojnie dostarczonych przez Raymonda Meyna, Jr., University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA) (pierwotnie stworzony przez Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Kalifornia, USA) (32). Geneteryna i higromycyna B zostały wstrzymane 48 godzin przed każdym eksperymentem. Świeżo izolowane komórki nabłonkowe dróg żółciowych szczura (IBDEC) przygotowano z normalnych szczurów metodą immunomagnetycznego oddzielania komórek, jak opisano uprzednio (33) i inkubowano w określonych pożywkach uzupełnionych inaktywowaną ciepłem surowicą cielęcą aż do przylegania, około 12 godzin po izolacji. Gdy komórki były adherentne, indukowano apoptozę. Apoptoza została wywołana przez napromieniowanie komórek światłem ultrafioletowym B (UV-B) (1650 J / m2 dla komórek T HeLa i Jurkat, 2200 J / m2 dla wszystkich innych komórek), jak opisano wcześniej (12). Świeże pożywki dodano następnie do komórek przed inkubacją w 37 ° C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2: 6 godzin dla komórek Jurkat T, 8 godzin dla HeLa i 16 godzin dla innych typów komórek. Dawkę UV-B i czas przechowywania każdego rodzaju komórek w inkubatorze po napromieniowaniu dostosowano dla każdego typu komórek w celu uzyskania równoważnych ilości apoptozy, co oceniono za pomocą morfologii (pęcherzykowanie cytoplazmatyczne i kondensacja chromatyny) i biochemicznej (kaspaza). cięcie kryteriów polimerazy polipeptydu poli-ADP [PARP]). Dla każdego typu komórki uzyskano więcej niż 90% cięcia PARP po indukcji apoptozy. W niektórych doświadczeniach do medium dodano 24 godziny przed napromieniowaniem UV-B butionina sulfoksyiminy (BS.) (100. M) i po napromieniowaniu dodano do komórek świeżą pożywkę zawierającą BSO. Całkowite poziomy glutationu zmierzono za pomocą modyfikacji metody opisanej pierwotnie przez Griffitha (34). Apoptoza była alternatywnie indukowana przez inkubację komórek HeLa (6 godzin), komórek Caco-2 (16 godzin) i NRC (16 godzin) w podłożach zawierających staurosporynę (odpowiednio 0,5 .M, 2,5 .M i 2,5 .M). . Pobranie surowicy i zawartość granulatu oczyszczonego z cytotoksycznych komórek T były również stosowane do indukowania apoptozy komórek HeLa i NRC, jak opisano wcześniej (18). W przypadku komórek HeLa i komórek T Jurkat, ligację powierzchni komórki Fas przez inkubację z mAb CH11 (2 ug / ml, Kamiya Inc., Seattle, Washington, USA) odpowiednio przez 16 godzin lub 6 godzin, również zastosowano do wywołania apoptozy. (30). Analiza Western blot dla PDC-E2. Lizaty komórkowe rutynowo przygotowano jak opisano uprzednio (13) w obecności czynnika redukującego, DTT (5 mM).
[hasła pokrewne: szkoła rodzenia madalińskiego, suplementy na wypadanie włosów, niepokój manipulacyjny ]
[przypisy: kalendarz triathlon 2015, krem pod oczy z peptydami, sok z buraka właściwości ]