Bcl-2-zależne utlenianie pirogronianowej dehydrogenazy-E2, pierwotnego autoantygenu żółciowej dróg żółciowych, podczas apoptozy cd

Po dodaniu buforu do próbek i gotowaniu próbki poddawano elektroforezie na 10% żelach SDS-poliakrylamidowych. Białko (80 .g) załadowano na każdą ścieżkę. Białka przeniesiono następnie do nitrocelulozy i poddano immunoblottingowi z surowicami PBC pacjenta (1: 2500) lub surowicami SLE specyficznymi dla PARP (1: 10 000), NuMA (1: 10 000) lub U1 70K (1: 10 000), trzech znanych antygenów być rozszczepiane przez kaspazy, a następnie sprzężone z peroksydazą chrzanową (sprzężone z HRP) kozim antyludzkim IgG wtórnym Ab jak opisano (13). Większość surowic pacjentów PBC rozpoznaje PDC-E2 (człowiek, 74 kDa, szczur 66 kDa), a także inne prążki białkowe. Dwie z dwudziestu pięciu badanych surowic były monospecyficzne dla PDC-E2 w lizatach NRC (Ryc. 1, ścieżka 1). Tożsamość pojedynczego prążka białka jako PDC-E2 potwierdzono w następujący sposób. Preinkubowanie surowic przez godzinę z oczyszczonym świńskim PDC (10 .g / ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) hamowało wykrywanie immunoblotowanego pasma 66 kDa (linia 2). Nie wykryto pasma podczas plamienia tylko z drugorzędowym Ab (linia 3). Figura 1Pacjent pacjenta z surowicą PBC immunoblot PDC-E2. W celu zidentyfikowania monoklonalnych surowic PBC dla PDC-E2 (66 kDa), zredukowany lizat NRC (80 .g na ścieżkę żelową) poddano immunoblottingowi z surowicami PBC pacjenta (rozcieńczonym 1: 2500). Dwie z dwudziestu pięciu badanych pacjentów wykryły jedynie prążek 66 kDa (linia 1), a preinkubacja tych surowic z oczyszczonym PDC (linia 2) blokowała wykrywanie tego pasma białka. Nie wykryto pasma białkowego podczas bibuły tylko z wtórnym Ab (linia 3). Markery wielkości molekularnej (Mr × 10. 3) są pokazane po lewej stronie. Blotting przez każdą monoswoistą surowicę badano trzykrotnie z identycznymi wynikami. Przedstawiono reprezentatywny blot. W celu porównania rozpoznawania autoprzeciwciał PBC utlenionego względem zredukowanego PDC-E2, dodano lizaty glutationowe (GSSG) (10 mM) lub 5 mM DTT (5 mM) do lizatów po dodaniu buforu do próbek zawierającego SDS i wrzenia z lizaty. Traktowane lizaty następnie poddano PAGE i białka przeniesiono na nitrocelulozę do immunoblotingu z surowicami PBC pacjenta. Miareczkowanie (1000-krotnie do 256000-krotnego) wykonano dla pięciu różnych surowic pacjentów PBC. Lokalizację subkomórkową PDC-E2 w komórkach kontrolnych względem apoptotycznych porównano za pomocą lizatów immunoblotowych frakcji subkomórkowych otrzymanych z komórek kontrolnych i apoptotycznych z surowicami PBC pacjenta, jak opisano wcześniej (35). Barwienie immunofluorescencyjne PDC-E2. W celu barwienia immunofluorescencyjnego, komórki hodowane na szklanych szkiełkach numer przemywano dwukrotnie w lodowatym PBS bez wapnia lub magnezu, utrwalano w 4% paraformaldehydzie (5 minut w 4 ° C) i permeabilizowano w acetonie (20 sekund w 4 ° C) . Komórki barwiono przez kolejne 20-minutowe inkubacje w 4 ° C z monospecyficznymi surowicami pacjenta (rozcieńczonym 1: 400) i skoniugowanym z FITC kozim przeciwciałem przeciw ludzkiej IgG (1: 100). W niektórych przypadkach komórki były podwójnie znakowane przez dodatkowe sekwencyjne inkubacje z normalną surowicą kozią (1: 100) w celu zablokowania reaktywności krzyżowej, a następnie mysie mAb specyficzne dla COX-1 (5 ug / ml) i Texas czerwony. skoniugowany kozie anty-mysie IgG wtórne Ab (1:50). Alternatywnie, do oznaczenia mitochondriów zastosowano mitotracker. Komórki zabarwiono 4p, 6a-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI, Molecular Probes Inc.) w celu identyfikacji komórek apoptotycznych przez kondensację chromatyny i fragmentację jądrową i wybarwiono jodkiem propidyny (Molecular Probes Inc.) w celu wykrycia pęcherzyków cytoplazmatycznych jako opisane wcześniej (14). Nakładki zostały następnie zamontowane na szklanych szkiełkach mikroskopowych (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pennsylvania, USA), a mikroskopia konfokalna została przeprowadzona na skaningowym mikroskopie konfokalnym (LSM 410, Carl Zeiss Inc., Thornwood, New York, USA). Eksperymenty powtórzono przy użyciu obu surowic pacjenta o monoswoistym PBC PDC-E2. Immunoprecypitacja PDC-E2. Immunoprecypitację białek znakowanych [35S] -methionine z lizatów komórek HeLa przy użyciu surowicy odpornościowej pacjenta przeprowadzono jak opisano wcześniej (18). Immunoprecypitację powtórzono osobno, stosując surowicę od pięciu różnych pacjentów z PBC, jak również od zdrowego osobnika. Każdy immunoprecypitat podzielono na pół i traktowano GSSG (10 mM) lub DTT (5 mM) przed rutynową SDS-PAGE i wykrywanie metodą autoradiografu immunoprecypitowanych białek znakowanych [35S] -metioniną. Wyniki PDC-E2 nie ulega rozszczepieniu podczas apoptozy. Apoptozę indukowano w NRC stosując napromienianie UV-B. Wiadomo, że PARP, autoantygen w SLE, jest cięty przez kaspazy podczas apoptozy. W zredukowanych lizatach kontroli i apoptotycznych NRC autoantygeny poddawano immunoblottingowi przy użyciu surowicy pacjenta PBC i SLE. Poziomy nienaruszonych autoantygenów SLE były zmniejszone w lizacie apoptotycznym względem kontrolnym (Figura 2, ścieżki 8 i 7, odpowiednio) towarzyszące pojawieniu się oczekiwanego fragmentu cięcia kaspazy z każdego autoantygenu SLE, potwierdzając indukcję apoptozy
[przypisy: przychodnia ożarów mazowiecki, narodowy fundusz zdrowia w łodzi, mleko z biedronki wycofane ]
[podobne: redukcja tkanki tłuszczowej dieta, szkoła rodzenia madalińskiego, mleko z biedronki wycofane ]