Bcl-2-zależne utlenianie pirogronianowej dehydrogenazy-E2, pierwotnego autoantygenu żółciowej dróg żółciowych, podczas apoptozy czesc 4

Przeciwnie, nie obserwowano cięcia PDC-E2 lub jakiegokolwiek innego autoantygenu PBC w apoptotycznym lizacie NRC (Figura 2, ścieżki 2, 4 i 6). Analiza densytometryczna pasm autoantygenu PBC nie wykazała istotnej różnicy intensywności. Podobnie, nie obserwowano utraty nietkniętego PDC-E2, stosując zawartość surowicy do odstawiania, staurosporyny lub CTL w celu wywołania apoptozy NRC (dane nie przedstawione). Apoptozę indukowano również w komórkach T HSG, HeLa i Jurkat za pomocą naświetlania UV-B, jak również innych bodźców apoptotycznych, jak odnotowano w Methods. We wszystkich przypadkach nie obserwowano utraty nienaruszonego PDC-E2 w lizatach apoptotycznych metodą immunoblottingu (dane nie przedstawione). Figura 2PDC-E2 nie jest cięty podczas apoptozy. Zredukowane lizaty NRC z komórek kontrolnych (C) i komórek apoptotycznych (A) poddano immunoblottingowi za pomocą trzech różnych surowic pacjentów PBC (ścieżki 1. 6) i surowic pacjentów SLE monospecyficznych dla NuMA (ścieżki 7 i 8, górny panel), PARP (ścieżki 7). i 8, środkowy panel) i U1 70K (linie 7 i 8, dolny panel). Apoptoza została wywołana przez naświetlanie UV-B. Równe ilości białka poddawano elektroforezie w każdej ścieżce żelu. W lizatach apoptotycznych (ścieżki 2, 4 i 6) nie obserwowano utraty nietkniętego PDC-E2 (66 kDa) ani żadnych fragmentów cięcia PDC-E2 w porównaniu z lizatami kontrolnymi (ścieżki 1, 3 i 5, odpowiednio). Podobnie, nie wykryto cięcia żadnego innego autoantygenu PBC. Blotowanie NuMA, PARP i U1 70K w lizacie apoptotycznym wykazało generowanie ich oczekiwanych fragmentów cięcia kaspaz (ścieżka 8), potwierdzając indukcję apoptozy. Markery wielkości molekularnej (Mr × 10. 3) są pokazane po lewej stronie. Blotting każdej surowicy badano co najmniej trzy razy z identycznymi wynikami. Przedstawiono reprezentatywny blot. Rozpoznanie PDC-E2 przez autoprzeciwciała pacjenta PBC po apoptozie zmienia się w specyficzny sposób typu komórki. Lokalizację PDC-E2 w komórkach kontrolnych i apoptotycznych porównano poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne. NZK były obarczone kosztami surowic pacjentów z PBC monoswoistych dla PDC-E2 i mAb swoistych dla COX-1, również mitochondrialnego białka błony wewnętrznej. PDC-E2 barwione w punktowym, okołojądrowym wzorze (Figura 3a) typowym dla wybarwienia mitochondrialnego, który był podobny do COX-1 (Figura 3e). Barwienie PDC-E2 także kolokalizowano z barwieniem przez mitotracker red (dane nie pokazane). Stosując to samo drugorzędowe Ab, surowica ze zdrowej kontroli i surowic od dwóch pacjentów z AIH i dwóch pacjentów z PSC nie zabarwiła mitochondriów (dane nie pokazane). Nie obserwowano barwienia samego Ab (brak danych). Figura 3 Barwienie PDC-E2 przez surowice pacjentów PBC w komórkach apoptotycznych nie lokalizuje się w pęcherzykach błony komórkowej lub ciałkach apoptotycznych. Zarówno komórki kontrolne jak i komórki traktowane UV-B w celu indukowania apoptozy badano za pomocą konfokalnej, immunofluorescencyjnej mikroskopii. Komórki wybarwiono DAPI (niebieski) (ayh) w celu rozróżnienia komórek apoptotycznych (komórki znakowane gwiazdami) z charakterystyczną skondensowaną, fragmentowaną chromatyną z komórek nieapoptotycznych (komórki niewyznakowane). Kontrola NRC była obarczona kosztem monoswoistej surowicy krwi PBC dla PDC-E2 (zielony) (a) i mAb specyficznego dla COX-1 (czerwony) (e). Immunoreaktywność przeciwko PDC-E2 i COX-1 skolonizowanym w mitochondriach. W apoptotycznych NRC immunoreaktywność przeciwko PDC-E2 (zielona) (b) pozostawała okołojądrowa i kolokalizowana z COX-1 (czerwony) (f). Preinkubacja surowic pacjenta z PBC z oczyszczonym PDC-blokowanym wybarwianiem PDC-E2 (zielony) w obu niekapitotycznych i apoptotycznych NRC (g). Komórki wybarwiono PI (czerwony) w celu odróżnienia pęcherzyków błony komórkowej lub ciał apoptotycznych w komórkach apoptotycznych (cid). Barwienie PDC-E2 (zielone) w apoptotycznych NRC nie umiejscawiało się w pęcherzykach błony komórkowej lub ciałkach apoptotycznych (c). Przeciwnie, immunoreaktywność przeciw PDC-E2 (zielona) nie została wykryta w apoptotycznych komórkach HeLa (d), chociaż wykryto immunoreaktywność przeciwko COX-1 (czerwony) (h). Każde doświadczenie powtórzono dwukrotnie z każdą z monoswoistych surowic pacjentów PBC z identycznymi wynikami. Bar, 20 m. Wyświetlane są reprezentatywne obrazy. Po napromieniowaniu UV-B w celu wywołania apoptozy, barwienie PDC-E2 w apoptotycznych NRC (Figura 3b, komórki apoptotyczne są znakowane gwiazdą) ponownie kolokalizowano z barwieniem COX-1 (Figura 3f) i nie kolokalizowano z jodkiem propidyny (PI ) barwienia pęcherzyków błony powierzchniowej lub ciał apoptotycznych (Figura 3c). Preinkubacja surowic pacjentów z PBC z oczyszczonym świńskim blokowanym PDC PDC-E2 w apoptotycznych i nieapoptotycznych NRC (Figura 3g, komórki apoptotyczne są oznaczone gwiazdką). Niespodziewanie, PDC-E2 w apoptotycznych komórkach HeLa było niewykrywalne przez immunobarwienie po naświetlaniu UV-B (Figura 3d; komórki apoptotyczne są oznaczone gwiazdką). Przeciwnie, napromienione, nieapoptotyczne komórki HeLa promieniujące UV-B (komórki pozbawione kondensacji chromatyny i pęcherzykowanie membranowe) silnie zabarwione na PDC-E2 (Figura 3d, komórki nie oznaczone gwiazdką)
[więcej w: sok z buraka właściwości, narodowy fundusz zdrowia w łodzi, zss kolbuszowa dolna ]
[przypisy: suplementy na wypadanie włosów, zst kolbuszowa, kolbuszowa dolna ]