CEACAM6 działa jako receptor adherentno-inwazyjnych E. coli, wspomagając kolonię błony śluzowej jelita cienkiego w chorobie Leśniowskiego-Crohna ad 8

Szczep LF82 E. coli, wyizolowany z przewlekłej zmiany jelita krętego pacjenta CD, zastosowano jako szczep referencyjny dla AIEC, a także 4 innych szczepów AIEC, LF31, LF71, LF73 i LF100 (12). Mutanty Pili-ujemne LF82 typu niosące insercję transpozonu Tn5phoA do fimA (52D11) lub genu fimH (ZG2) zostały wcześniej wygenerowane (14). Mutanty izogeniczne AIEC-a fimH wytworzono za pomocą produktu PCR, stosując metodę opisaną przez Datsenko i Wannera (44) i zmodyfikowaną przez Chaveroche i in. (45). Zrekombinowany szczep K-12 E. coli niosący pPil38 zawierający cały klonowany operon fimu zastosowano do testów adhezji (46). Bakterie rosły rutynowo w bulionie Luria-Bertani (LB) lub na płytkach agarowych LB lub Mueller-Hinton (BD) przez noc w 37 ° C bez wytrząsania. Adhezja in vitro do wyizolowanych enterocytów. Testy adhezji in vitro przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (22, 24). Izolowane enterocyty przygotowano z próbek jelita zamrożonych w temperaturze ~ 80 ° C w MEM (Seromed Biochrom) zawierających 10% glicerolu i 10% DMSO (Sigma-Aldrich) natychmiast po usunięciu. Zamrożone próbki jelitowe przemyto 3 razy PBS (pH 7,2), a błona śluzowa jelita krętego została zdrapana szkiełkiem nakrywkowym w celu oddzielenia enterocytów. W przybliżeniu 105 izolowanych enterocytów zmieszano z 108E. komórki coli w MEM zawierające 10% dezaktywowanego termicznie FCS (Seromed Biochrom). Po 2-godzinnym okresie inkubacji w 37 ° C z łagodnym wytrząsaniem, enterocyty przemyto 3 razy PBS. Adhezję bakteryjną oznaczono ilościowo przez badanie w mikroskopie z kontrastem fazowym przy powiększeniu x 1,000. Liczbę bakterii E. coli przylegających do granicy szczotek z 30. 50 enterocytów zliczono w dwóch powtórzeniach. Eksperymenty z enterocytami przeprowadzono w dwóch powtórzeniach przez co najmniej 2 różnych eksperymentatorów. Indeks adhezji wyrażono jako średnią liczbę bakterii przyłączonych do granicy szczoteczkowej enterocytu. Testy adhezji zahamowania przeprowadzono w obecności 2% (wag./obj.) D-mannozy (Sigma-Aldrich) w MEM zawierającej 10% FCS lub po 30-minutowym wstępnym traktowaniu enterocytów w temperaturze 37 ° C przy użyciu różnych przeciwciał. Następnie dodano bakterie, a testy adhezji przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Przeciwciała monoklonalne anty-CD48, anty-CEACAM1, anty-CEACAM5 i anty-THP (PeliCluster; Tebu-Bio) i monoklonalne przeciwciała przeciw klonem 9A6 CEACAM6 zastosowano w rozcieńczeniu 1: 100 w MEM zawierającym 10% FCS. Analiza obecności wolnych resztek mannozy na granicy szczoteczki enterocytowej. Izolowane enterocyty inkubowano przez godzinę w PBS zawierającym 50 .g / ml lektyny ConA-FITC (Sigma-Aldrich), która specyficznie wiąże się z resztami mannozy. Po 4 przemyciach, enterocyty obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy powiększeniu x 400. Immunohistochemia na próbkach z jelita krętego. Immunohistochemię przeprowadzono na odcinkach 4. M utrwalonych w formalinie próbek tkanek zatopionych w parafinie przy użyciu metody kompleksu peroksydazy awidyny-biotyny i 3-amino-chromogenu 9-etylo-karbazolu. Skrawki poddawano indukowanemu ciepłem epitopowi z wykorzystaniem szybkowaru przez 3 minuty. W rozcieńczeniu 1:25 zastosowano mysi anty-ludzki klon przeciwciała monoklonalnego CEACAM6 9A6. Skrawki wybarwiono kontrastowo hematoksyliną Mayera. Analiza jakościowego barwienia skupiała się na typie zabarwionych komórek, wzorze barwienia i jego dystrybucji. Barwienie CEACAM6 pojedynczych próbek tkanek przez przeciwciała monoklonalne porównano i podzielono na 4 grupy od negatywnego (a) do silnie pozytywnego (+++): ((3) wskazuje na negatywne zabarwienie cytoplazmy i powierzchni nabłonka; (+) słabo dodatnie zabarwienie powierzchni nabłonka rozproszonych komórek; (++) słabo do umiarkowanie pozytywnego zabarwienia cytoplazmy i powierzchni nabłonka większości komórek; i (+++) silnie pozytywne barwienie cytoplazmy i powierzchni nabłonka większości komórek. Dla wszystkich pozytywnie zabarwionych skrawków, sąsiednie sekcje barwiono także monoklonalną mysią IgG1 (Sigma-Aldrich) jako kontrolną dopasowaną izotypem. Hodowla komórkowa, transfekcja i testy adhezji in vitro. Komórki Caco-2, T84, HT29, HCT-116, Colo205, SW480, LS174, Int-407 i HeLa otrzymano z ATCC i hodowano jak opisano wcześniej (47). Dwa oligonukleotydy, 19 reszt długości (5a-CCUCCUAAUAGUCAUACUA-3a specyficzne dla ludzkiego mRNA CEACAM6 i 5 (3 -UUCUCCGAACGUGUCACGU-3a jako kontrola), wybrano do syntezy siRNA i transfekowano kationowym lipidem (Lipofectamine 2000; Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Utratę ekspresji CEACAM6 przez siRNA potwierdzono za pomocą analizy Western blot. W celu określenia całkowitej liczby bakterii związanych z komórkami odpowiadających adherentnym i wewnątrzkomórkowym bakteriom, komórki Caco-2 ulegały lizie po 3-godzinnym okresie infekcji, a bakterie określano ilościowo, jak opisano wcześniej (14). Eksperymenty ekstrakcji białek i immunoblotów
[hasła pokrewne: polskie towarzystwo ultrasonograficzne, wydłużenie etapu edukacyjnego uzasadnienie, stężenie alkoholu we krwi kalkulator ]
[więcej w: przychodnia ożarów mazowiecki, badanie kału na pasożyty, polskie towarzystwo ultrasonograficzne ]