CEACAM6 działa jako receptor adherentno-inwazyjnych E. coli, wspomagając kolonię błony śluzowej jelita cienkiego w chorobie Leśniowskiego-Crohna ad 9

Komórki wysiano na 6-studzienkowe płytki i stymulowano 24 godziny później 50 ng / ml IFN-y. lub TNF-a przez lub 2 dni. Usunięto pożywkę i 300 ul buforu do lizy (1% Triton X-100, 0,1 M NaCl, 10 mM HEPES pH 5,6, 2 mM EDTA, 4 mM Na3VO4, 40 mM NaF) uzupełnionego koktajlem inhibitora proteazy (Complete Mini; Roche ) zostało dodane. Lizaty zebrano i przepuszczono 10 razy przez igłę 21G. Frakcję rozpuszczalnego białka otrzymano przez odwirowanie przy 10000 g przez 30 minut w 4 ° C. Stężenie białka określono przy użyciu zestawu DC Protein Assay (Bio-Rad). Dziesięć mikrogramów białek ze wszystkich komórek rozdzielono na 4%. 12% żeli Tris-glicynowych (Invitrogen), przeniesiono na membrany PVDF i wybarwiono stosując mysie przeciwciało anty-ludzkie CEACAM6 monoklonalne klonu 9A6 dla CEACAM6 i kozie anty-ludzką P-aktynę. przeciwciało poliklonalne (C-11, Santa Cruz Biotechnology Inc.) dla (3-aktyny. Ekspresję pili typu przez bakterie analizowano ekstraktami z całych komórek. Po całonocnej inkubacji w 37 ° C w bulionie LB, bakterie przy tym samym OD odwirowano i ponownie zawieszono w buforze obciążającym SDS-PAGE i ogrzewano przez 5 minut w 95 ° C. Preparaty białka zakwaszono HCl, ogrzewano przez 5 minut w 95 ° C i rozdzielono przez 12% SDS-PAGE. Western immunoblotting przeprowadzono przy użyciu przeciwciał pili E. coli typu (hojny dar Maryvonne Moulin-Schouleur, Pathogénie Bactérienne, UR86, INRA, Nouzilly, Francja). Immunoreagenty wykrywano stosując przeciwciało HRPa anty-królicze IgG (rozcieńczone 1: 10 000), odczynniki ECL (Amersham) i autoradiografię. Mikroskopia konfokalna. Komórki HeLa, komórki HeLa eksprymujące ludzką CEACAM6 i komórki Caco-2 wysiano na sterylne szkiełka nakrywkowe. Po 24 godzinach dla komórek HeLa lub 15 dni dla komórek Caco-2 komórki infekowano przez 3 godziny bakteriami LF82 wykazującymi ekspresję GFP (48) przy MOI wynoszącym 10. Komórki zabarwiono stosując mysie przeciwciało anty-ludzkie CEACAM6 monoklonalne klon przeciwciało 9A6 i Texas red. skoniugowane z anty-mysim IgG (Vector Laboratories) jako przeciwciało drugorzędowe. Komórki obserwowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 510 Meta. Rekonstrukcja 3D została wykonana przy użyciu oprogramowania Velocity (wersja 3.7.0). Statystyka. Test P2 użyto do porównania adhezji do CD i kontrolnych enterocytów oraz do analizy barwienia immunohistochemicznego, chyba że zmienne wymagały dokładnego testu Fishera z 2 ogonami. Wartość AP mniejsza lub równa 0,05 została uznana za statystycznie istotną. Do analizy znaczących różnic w innych danych użyto testu jednostronnego ucznia. Wartość AP mniejsza lub równa 0,05 została uznana za statystycznie istotną. Podziękowania Badanie to zostało poparte przez Ministę ds. Recherche et de la Technologie (EA3844), INRA (USC-2018) oraz dotacje ze Stowarzyszenia F. Aupetit (AFA) i Institut de Recherche des Maladies de l Appareil Digestif (IRMAD, Laboratoire Astra France). Z wdzięcznością dziękujemy Maryvonne Moulin-Schouleur (Pathogénie Bactérienne, UR86, INRA, Nouzilly, Francja) za przeciwciała pili E. coli typu 1. Dziękujemy Per Klemm (Centrum Mikrobiologii Biomedycznej, Lyngby, Dania) za dostarczenie plazmidu pPil38, Olivera Billkera i Thomasa F. Meyera (Max-Planck-Institut fur Infektionsbiologie, Berlin, Niemcy) za dostarczenie komórek HeLa transfekowanych ludzkim cDNA CEACAM6, i Cecilia Berin do krytycznego czytania rękopisu. Przypisy Niestandardowe skróty: AIEC, adherentnoinwazyjne E. coli; CD, choroba Crohna; CEACAM, cząsteczka adhezyjna pokrewnego antygenu rakotwórczego; ConA, concanavalin A; GPI, glikozylofosfatydyloinozytol; IBD, zapalna choroba jelit; LB, Luria-Bertani; THP, białko Tamm-Horsfall; UC, wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.117: 1566. 1574 (2007). doi: 10.1172 / JCI30504
[hasła pokrewne: kalendarz triathlon 2015, wydłużenie etapu edukacyjnego uzasadnienie, redukcja tkanki tłuszczowej dieta ]
[podobne: stężenie alkoholu we krwi kalkulator, kalendarz triathlon 2015, krem pod oczy z peptydami ]