Czynnik uwalniający histaminę ma prozapalną rolę w mysich modelach astmy i alergii ad 6

Spośród receptorów Igs i Fc, IgE i FcyRI były głównymi czynnikami wpływającymi na działanie HRF, ponieważ wywołane przez HRF zapalenie płuc było niemal zniesione w nie naiwnym FcpRl2 / y. myszy (Figura 7A). Ponieważ FcyRI jest wyrażany na komórkach tucznych i bazofilach u myszy (53), wyniki te były zgodne ze skutecznością peptydów N19 i H3 w modelach astmy zależnych od mastocytów (Figura 6 i dane nie przedstawione). Figura 7 Zapalenie płuc indukowane jest przez HRF u naiwnych myszy w sposób zależny od receptora Fc. Naiwny WT C57BL / 6 i zmutowane myszy traktowano 40 .g mHRF-His6 3 razy co trzeci dzień. PBS służyło jako kontrola negatywna. (A i B) wywołane przez HRF zapalenie płuc wymagało B i komórek tucznych, jak również FcyRI (i prawdopodobnie receptorów Fcsa). Procedury BAL prowadzono 24 godziny po ostatnim podaniu HRF. Zliczanie komórek różnicowych przeprowadzono na preparatach cytospinowych barwionych za pomocą May-Giemsa. (C) Geny, których ekspresja została podwyższona lub zmniejszona przez HRF. Czarne symbole,. 3-krotna zmiana; symbole pomarańczowe, od 3 do 5-krotnej zmiany; czerwone symbole,> 5-krotna zmiana. Geny, których ekspresja ulegała fluktuacjom: 3-krotne w WT, FcyRl. /. I FcR. /. myszy nie są pokazane na poletkach dla zmutowanych myszy. Linie przerywane i stałe wskazują odpowiednio 3- i 5-krotne różnice w ekspresji genów. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, Test końcowy ucznia. Każda kohorta składała się z 3. 5 myszy. Wszystkie dane są reprezentatywne dla 5 (WT) i 2 (mutantów) eksperymentów. Co ważne, brak reakcji komórek zapalnych na HRF w. MT lub FcR. /. myszy potwierdziły nasze odkrycie, że IgG związane z HRF (Figura 1). Aby dodatkowo ocenić docelowy zakres HRF, przeprowadziliśmy globalną analizę ekspresji genów. Ekspresja 196 genów była zwiększona lub zmniejszona ponad 3-krotnie przez HRF w płucach nieżywych myszy WT, z 90 genami zwiększonymi lub zmniejszonymi ponad 5-krotnie (Figura 7C). Geny o podwyższonej ekspresji obejmowały te kodujące cytokiny związane z Thl, Th2 i Th17 i różne chemokiny, potencjalnie odpowiadające rekrutacji monocytów / makrofagów, neutrofili, eozynofilów i innych komórek odpornościowych (Suplementalna Figura 16). Ekspresję niektórych cytokin Th1 i Th2 potwierdzono za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym (dane nie przedstawione). Inne geny o podwyższonej ekspresji obejmowały wcześniej zgłoszone geny w mysich modelach astmy, takie jak Agr2, Ccl8, Cclll, Fcgr2b, Scin, Serpina3g, Serpina3n i Timp1. Jednak tylko niewielka część tych genów (39 z 196) ulegała fluktuacjom ponad 3-krotnie w Fc. Rl. /. myszy; ponadto, mniej genów (11 z 196) zostało zmienionych w FcR /. myszy (Figura 7C). Wyniki te sugerują, że HRF wykonuje swoje działanie głównie, jeśli nie wyłącznie, przez angażowanie receptorów Fc związanych z IgE i IgG i promuje zapalenie dróg oddechowych. Dyskusja Pomimo znacznych wysiłków w ciągu ostatnich 15 lat od czasu klonowania HRF (4), nie zidentyfikowano receptora HRF. Stosując testy funkcjonalne na komórkach tucznych szczura RBL-2H3 eksprymujących ludzki FcyRI, Wantke i in. pośrednio sugeruje, że ludzki rekombinowany HRF nie wiąże się z IgE (34). Jednakże wyraźnie wykazaliśmy, że podgrupa IgE i IgG może wchodzić w interakcje z HRF. Nasze badanie różni się od badania Wantke i wsp., Ponieważ używali oni ludzkich komórek RBL-2H3 eksprymujących FcyRI, które w naszych rękach były trudne do aktywacji. Co ważne, w teście wiązania opartym na ELISA wykorzystano ponad tuzin mAb IgE, w porównaniu z 2 rodzajami poliklonalnego IgE stosowanego w poprzednim badaniu. Ponadto, wiązanie HRF niektórych mAb IgE zostało potwierdzone przez pulminację powinowactwa i cytometrię przepływową. HRF oddziałuje z regionem Igs Fab, ale nie Fc. Eksperymenty z antygenem OVA i jednowartościowymi haptenami sugerowały, że miejsce wiązania mHRF w IgE częściowo pokrywa się z miejscami wiązania antygenu. Inspekcja sekwencji aminokwasowych regionów V ograniczonej liczby cząsteczek IgE i IgG wskazuje, że reaktywne wobec HRF IgE i IgG zawierają unikalne sekwencje Vk (odpowiednio 8-30 i 2 x 137, Tabela dodatkowa 1). W przeciwieństwie do tych IgE i IgG używają różnych członków rodziny VH. Peptyd N19 wiążący Ig tworzy 2 antyrównoległe a-kartki (pozycje 3. 5 i 14. 15), które, razem z C-końcowym arkuszem., Tworzą 3-niciowy arkusz B (54, 55). Struktura składająca się z arkusza B, 4-niciowego arkusza A i małej helisy jest podobna do ludzkiej proteiny Mss4, która wiąże się z białkami Rab i została zaproponowana jako chaperon wolny od nukleotydów guaniny (56). Inną domeną H3 oddziałującą z Ig jest długa a-helisa umieszczona na części arkusza A. Nasze obserwacje łącznie sugerują, że 2 miejsca HRF wchodzą w interakcję z regionami V specyficznie. Jednak dane dotyczące hamowania haptenu oddziaływań HRF-Ig nie mogą wykluczyć możliwości, że wiązanie HRF-Ig zostanie wprowadzone przez stosunkowo niespecyficzne oddziaływania jonowe lub inne oddziaływania różnych części Ig. Jak wykazali inni (57, 58), nasze bakteriobójcze preparaty mHRF mogą tworzyć dimer [więcej w: narodowy fundusz zdrowia w łodzi, kolbuszowa dolna, wydłużenie etapu edukacyjnego uzasadnienie ] [więcej w: badanie kału na pasożyty, polskie towarzystwo ultrasonograficzne, stężenie alkoholu we krwi kalkulator ]