Czynnik uwalniający histaminę ma prozapalną rolę w mysich modelach astmy i alergii ad 8

Ponadto, podobny mechanizm oparty na HRF promuje amplifikację wywołanego alergenem zapalenia przez aktywację komórek tucznych i bazofili, w których kompleksy FcyRI są zajęte suboptymalnie IgE swoistym dla alergenu (lub raczej zajęte niespecyficznymi IgE), aby odpowiedzieć na alergen. Potencjalnie sprzeczne z powyższym scenariuszem, płyny SERA i BAL od naiwnych myszy zawierają HRF, który nie wydaje się wywoływać stanu zapalnego w warunkach homeostatycznych. Wydaje się, że istnieją mechanizmy hamujące stany zapalne potencjalnie indukowalne przez endogenny HRF. Endogenna ilość HRF może być niższa niż próg dla HRF do wywoływania stanu zapalnego. Alternatywnie, mogą istnieć endogenne inhibitory, które hamują funkcje zewnątrzkomórkowe HRF. Te możliwości są warte zbadania. Podsumowując, nasze badanie wykazało, że bioaktywny HRF (tj. Dimery i oligomery) wchodzi w interakcje z niektórymi cząsteczkami IgE i może sieciować ten FcRIr związany z IgE. FcyRI agreguje aktywowane komórki tuczne in vitro. Inhibitory, które zapobiegają interakcjom HRF-Ig, hamowały IgE / wywołaną przez antygen nadwrażliwość skóry i wywołane alergenem zapalenie komórek dróg oddechowych zależne od mastocytów. Zatem dochodzimy do wniosku, że HRF promuje alergiczne zapalenie skóry i płuc. Metody Myszy. Myszy C57BL / 6 i Balb / c zakupiono w Jackson Laboratory. Użyto także myszy FcsRIl / a, FcRy / a, i | MT. Przygotowanie rekombinowanego mHRF. cDNA mHRF amplifikowano za pomocą RT-PCR, stosując startery wymienione w Tabeli dodatkowej 2. Geny fuzyjne GST oczyszczono przy użyciu agarozy glutationowej (Sigma-Aldrich). mHRF-His6 eksprymowany przez plazmid pET-24a (+) oczyszczono stosując żywicę ProBond (Invitrogen). Wszystkie rekombinanty dalej oczyszczono przez Sephacryl S-100 i dializowano wobec PBS. Preparaty mHRF-His6 zawierały mniej niż 0,05 pg / .g białka endotoksyny, jak zmierzono testem lizatu amebocytów Limulus. ELISA. Płytki ELISA z 96 zagłębieniami opłaszczano przez noc za pomocą GST, GST-mHRF lub mHRF-His6 (każdy przy 10 ug / ml w 0,1 M buforze węglanowym [pH 9,5]). Płytki przemyto i zablokowano 10% FCS lub 1% BSA. Następnie mysie cząsteczki IgE i IgG (10 .g / ml), osocze (rozcieńczenie 1: 100 A 1: 200) i płyny BAL (rozcieńczenie 1:10) inkubowano w powleczonych studzienkach, po czym związane IgE wykryto inkubację z biotynylowaną anty-mysim IgE, a następnie ze sprzężoną z HRP streptawidyną. Związane IgG wykrywano przez inkubację ze skoniugowanym z HRP anty-mysim IgG. Kolor został opracowany przy użyciu substratu TMB (BD Biosciences) i zmierzono absorbancję przy 450 nm. Źródła IgE i IgG wymieniono w Tabeli dodatkowej 3. Dziedziczenie pulldown IgE z GST-mHRF. MAb IgE (3 .g) w 100 .l 1% Triton X-100 / PBS inkubowano z 10 .g kulek agarozowych GST lub GST-mHRFa. Związane z kulkami IgE zostały zebrane przez odwirowanie. Białka IgE i GST wymyte buforem do próbek SDS wykryto przez immunoblotting odpowiednio z przeciwciałem przeciw mysiemu IgE i mAb anty-GST. Pomiar powinowactwa wiązania metodą mikrowagi kwarcowej. Test oparty na mikrowagach kwarcowych (oparty na QCM) przeprowadzono przy użyciu aparatu Affinix Q4 (Initium Co. Ltd.), jak opisano wcześniej (64). Komórki tuczne. BMMC wytworzono przez hodowlę komórek szpiku kostnego w IL-3 (65). Zastosowano także otrzewnowe komórki tuczne oczyszczone przy użyciu zestawu pozytywnego doboru anty-c-Kit (StemCell Technologies). Wzrost i apoptoza hodowanych komórek. Komórki CHO-K1, Jurkat i Caco-2 hodowano pod nieobecność lub bez obecności GST lub GST-N19 przez 4 dni i zliczano żywe komórki. Apoptozę indukowano przez zubożenie IL-3 w BMMC przez 4 dni i przez 800 nM H2O2 w komórkach CHO-K1 przez 2 dni i zliczano żywe komórki. Mikroskopowa lokalizacja GST-N19 i innych białek fuzyjnych GST. BMMC inkubowano w 37 ° C z 20 lub 200 .g / ml prototypu fuzyjnego GST lub GST przez 0 do 24 godzin. Umyte komórki osadzono na szklanych płytkach. Po utrwaleniu komórki permeabilizowano lodowatym metanolem, a następnie wybarwiono anty-GST, a następnie skoniugowaną z antygenem IgG Alexa Fluor 488 (3. W celu zamontowania szkiełek użyto ProLong Gold antifade z DAPI (Invitrogen). Fluorescencję obserwowano dla konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego FLUOVIEW FV10i (Olympus). Degranulacja. Komórki tuczne uczulano przez noc za pomocą IgE. Komórki stymulowano TNP26-BSA lub mHRF-His6 przez 45 minut. Zmierzono ilość histaminy lub a-heksoaminidazy w supernatantach. PCA. Myszy uczulono przez wstrzyknięcie IgE do ucha z 0,5 .g mAE IgE. 24 godziny później kolejno wstrzyknięto niebieski barwnik Evansa (iv) i mHRF-His6 (10 ug, id)
[patrz też: krem pod oczy z peptydami, instytucje zajmujące się pomocą dla młodzieży z problemami rodzinnymi, kolbuszowa dolna ]
[hasła pokrewne: redukcja tkanki tłuszczowej dieta, szkoła rodzenia madalińskiego, mleko z biedronki wycofane ]