Czynnik VIII, który jest ektopowo ukierunkowany na płytki, jest terapeutyczny w hemofilii A z przeciwciałami hamującymi o wysokim mianie ad 7

To może zapewnić pacjentowi samoreplikującą się pulę komórek macierzystych, która będzie wspierać trwającą przez całe życie ekspresję transgenu FVIII w ich megakariocytach i płytkach krwi. Chroniona uwalniana pula FVIII w płytkach krwi zmniejszyłaby skazę krwotoczną nie tylko u pacjentów z hemofilią A, ale także u osób z przeciwciałami hemofilią A i przeciwciałami FVIII. Podczas gdy ta ostatnia grupa nie była wcześniej uważana za kandydata do terapii genowej FVIII, nasze obecne badania sugerują nowe podejście, które może być korzystne. Metody Konstrukcja wektora. Ludzki cDNA FVIII zastosowany w tym badaniu usunął całą domenę B FVIII i był miłym darem RJ Kaufmana (University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA). hBDDFVIII wycięto z wektora pMT2 (50) przez XhoI i SalI i użyto do wytworzenia wektora pIIb-BDDFVIIIneo, jak opisano w naszym poprzednim badaniu (22). Miejsca PvuI i Rsrll wprowadzono na początku promotora | llb w pIIb-BDDFVIIIneo za pomocą mutagenezy PCR. Otrzymany wektor, pIIb-BDDFVIIIneo (PvuI), zastosowano do uwolnienia kasety ekspresyjnej 2bF8 do generowania myszy transgenicznych. Generowanie transgenicznych myszy. Badania zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnacji i Użytkowania Zwierząt w Medical College of Wisconsin. Myszy transgeniczne wytworzono w Transgenic Core Facility w Medical College of Wisconsin and Blood Research Institute. Fragment 7,6-kb, zawierający promotor P1b, chimeryczny intron a -globiny / IgG, hBDDFVIII, SV40 Poly A i kasetę oporności na neomycynę, poddano elektroporacji do 129S komórek ES. Kolonie selekcjonowano przy użyciu G418 i przeszukiwano pod kątem obecności transgenu stosując strategię PCR pokazaną na Figurze 1A i wyszczególnioną w Tabeli stosując startery P1. P4 specyficzne dla transgenu 2bF8. Transgeniczne komórki ES propagowano do mikroiniekcji do blastocyst w celu wytworzenia chimerycznych myszy niosących transgen, a transgen 2bF8 był następnie hodowany do eksonowego 17 nokautu FVIII (51). Oznaczenie genotypu przeprowadzono za pomocą analizy PCR próbek genomowego DNA uzyskanych z krwi przy użyciu starterów, jak opisano powyżej. Tabela Sekwencje primerów Analiza lokalizacji insercji. Pozycję insercji transgenu 2bF8 określono metodą DNA Walking PCR, stosując zestaw DNA Walking SpeedUp (Seegene) zgodnie z instrukcjami producenta. Przeszukiwanie BLAST w banku Genów zidentyfikowało miejsce insercji na chromosomie 18 po podstawie 4667 klonu BAC RP23-127 B9. Parę starterów, M18-a4743 i M18-s4536 (Tabela 1), flankujących przypuszczalne miejsce wstawienia zaprojektowano w celu potwierdzenia rozerwania miejsca insercji u zwierząt transgenicznych. Generowanie myszy homozygotycznych 2bF8 i myszy VWFnull 2bF8trans. Homozygotyczne myszy 2bF8trans wytworzono z heterozygotycznych krycia. Genotyp oznaczono metodą PCR z użyciem startera P5 lub starterów M18-a4743 i M18-s4536 (Tabela i Figura 1). Ponadto, gody myszy 2bF8rans u myszy VWFnull (20) generowały myszy 2bF8transVWFnull. Myszy VWFnull zidentyfikowano za pomocą testu ELISA w fazie stałej z mysiego osocza, z użyciem króliczego przeciwciała przeciwko ludzkiemu VWF, które łączy się z mysim VWF (Dako) jako wychwytem Ab i znakowanego HRP Ab do wykrywania. Testy FVIII: C. Poziomy FVIII: C w osoczu myszy i lizacie płytek lub uwalnianiu oznaczono ilościowo za pomocą zmodyfikowanego testu chromogennego FVIII, który opracowaliśmy przy użyciu zestawu Coatest VIII: C / 4 (DiaPharm), jak opisano wcześniej (21, 23). Sto mikrolitrów krwi zebrano przez krwawienie ogonowe w probówkach zawierających 0,1 objętości 0,1 M cytrynianu sodu. Komórki usunięto przez odwirowanie przy 960 g przez 20 minut, a osocze zubożone w płytki badano na obecność FVIII: C w osoczu. W przypadku lizatu płytek lub testu uwalniania, płytki krwi rozdzielano stosując Fico / Lite-Platelets (Atlanta Biologicals) z 200 ul krwi z 50 ng / ml prostaglandyny E1 (Sigma-Aldrich). Oddzielone płytki krwi przemyto PBS zawierającym 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich) i 0,5% BSA (Invitrogen), zliczono za pomocą licznika krwi zwierzęcej (Heska) i odwirowano przy 960 g przez 20 minut. Osad płytek lizowano w 200 ul 0,5% 3 – [(3-cholamidopropylo) dimetyloamonio] -1-propanosulfonianu (CHAPS, obojnaczojonowy detergent, MP Biomedicals) przez wirowanie do zawieszania, inkubowano na lodzie przez 10 minut i wirowano. poniżej 20 800 g w 4 ° C przez 10 minut. Supernatant następnie testowano na FVIII: C. W celu przeprowadzenia testu uwalniania płytek krwi, świeże płytki ponownie zawieszono w 150 .l zmodyfikowanego buforu Tyrode a (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 13,8 mM NaHCO3, 0,36 mM NaH2PO4, 2,5 mM KCl, mM MgCl2, 5,5 mM glukozy i 0,25 % BSA) zawierającego mM CaCl2, 2. M ADP (Chrono-log Corporation) i 25. M każdego epinefryny (BIO / DATA Corporation) i peptyd aktywujący mysią receptora trombiny (GYPGKF-NH2, zsyntetyzowany przez nasze główne laboratorium) , inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie odwirowano przy 20 800 g w 4 ° C przez 10 minut
[patrz też: instytucje zajmujące się pomocą dla młodzieży z problemami rodzinnymi, zss kolbuszowa dolna, kolbuszowa dolna ]
[więcej w: kolbuszowa dolna, wydłużenie etapu edukacyjnego uzasadnienie, uzasadnienie wydłużenia etapu edukacyjnego ]