Czynnik VIII, który jest ektopowo ukierunkowany na płytki, jest terapeutyczny w hemofilii A z przeciwciałami hamującymi o wysokim mianie ad 8

Otrzymany supernatant zastosowano do oznaczenia uwolnionego FVIII: C. Mysie osocze rozcieńczono 1:40 w zmodyfikowanym buforze Tyrode i 25 ul rozcieńczonego osocza, uwolnionego z płytek lub seryjnie rozcieńczonego lizatu płytek dodano do zablokowanych 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania w trzech powtórzeniach. Składniki testu, w tym FIXa, FX, CaCl2 i fosfolipid, dodano do każdej studzienki i płytki inkubowano przez 10 minut w 37 ° C. Dodano chromogenny substrat czynnika Xa S-2222 i płytkę przeniesiono natychmiast do czytnika mikropłytek ThermoMax (Molecular Devices) wstępnie ustawionego na 37 ° C. Standardową krzywą skonstruowano przez wykreślenie znanych ilości rhBDDFVIII (Refacto; Wyeth) w odpowiednim buforze względem Vmax (mOD / min) przy 405 nm. Vmax każdej reakcji przekształcono w jednostki FVIII: C (U / ml) przy użyciu oprogramowania producenta instrumentu (SoftMax wersja 2.34, Molecular Devices), a dane uśredniono. Płytki krwi od myszy WT i FVIIInull służyły jako kontrola w testach uwalniania płytek lub lizatu. FVIII: C w lizacie komórek jednojądrzastych określono podobnie. Immunobarwienie dla hBDDFVIII. Wizualną detekcję hBDDFVIII w transgenicznych płytkach uzyskano za pomocą immunoglobuliny znakowanej immunofluorescencyjnie lub immunologicznie i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej lub EM. Kontrole (płytki od myszy FVIIInull) przetwarzano równolegle z każdym testem immunobarwienia w tych samych warunkach. W przypadku badań konfokalnych komórki wirowano na szkiełkach, utrwalano stosując formalinę buforowaną 3,7% (objętościowo), permeabilizowano 5% Tritonem X-100 i blokowano w 2,5% normalnej surowicy koziej w HBSS (Invitrogen) przez godzinę. Komórki inkubowano w pierwszorzędowym przeciwciele w 4 ° C przez noc. Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiemu FVIII (Conan, generowane przez nasze laboratorium) było bezpośrednio sprzężone z AlexaFluor 488 (Invitrogen), a przeciwciało królika przeciwko VWF (Dako) skoniugowano z AlexaFluor 568. Nieswoiste przeciwciała kontroli izotypowej służyły jako kontrole negatywne. Komórki umieszczono pod szklanymi szkiełkami przy pomocy Vectashield. Wykrywanie immunofluorescencji prowadzono za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu systemu do obrazowania laserowego Leica TCS SP2 (Leica Microsystems). W badaniach EM wyizolowane płytki przemyto w zmodyfikowanym buforze Tyrode i odwirowano przy 960 g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Osad utrwalono w 0,25% glutaraldehydzie plus 4% paraformaldehydzie i 0,2% (wag./obj.) Kwasu pikrynowego w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,3, na lodzie przez godzinę. Stałe granulki komórek poddano obróbce przy użyciu techniki wzmocnionego kontrastu membranowego (52) i osadzono w żywicy Lowicryl K4M, stosując wcześniej opisany protokół (53). Sekcje ultracienkie (o grubości 60 nm) zebrano na kratkach miedzianych pokrytych formarem / węglem. Wszystkie inkubacje przeprowadzono na kroplach o objętości 25 ul na parafilmie w nawilżonej komorze. Skrawki inkubowano z mAb anty-czynnika VIII, 103,3 lub poliklonalnym Ab skierowanym przeciwko VWF (Dako), a następnie sondowano kozimi anty-mysimi (5 nm) i kozimi anty-króliczymi (10 nm) sondami koloidalnego złota, odpowiednio. Sekcje zostały zaobserwowane w Hitachi H600 TEM (Hitachi High-Technologies) działającym przy 75 kV. Analiza korekcji fenotypu. Korektę fenotypową oceniano za pomocą testu przetrwania klatki ogonowej, jak opisano wcześniej (54-56). Ogony myszy znieczulonych w wieku 8 do 16 tygodni zostały obcięte na średnicy 1,59 mm, bez późniejszego kauteryzacji. Tworzenie skrzepu i czas przeżycia przekraczający 24 godziny zastosowano do wskazania korekty fenotypu mysiej hemofilii A. 2bF8trans BMT. Znieczulone myszy uśmiercano przez przemieszczenie kręgów szyjnych, a szpik kostny zbierano przez płukanie kości udowych i piszczeli, jak opisano wcześniej (23). Jednojądrzaste komórki wyizolowano za pomocą Fico / Lite-LM (mysz, Atlanta Biologicals), przemyto zimnym PBS zawierającym EDTA i BSA i ponownie zawieszono w PBS (Invitrogen) do przeszczepu. Sześcio- do 8-tygodniowym myszom FVIIInull (biorcom) kondycjonowano pod kątem przeszczepu komórkowego śmiertelną dawkę napromieniania całego ciała 1100 cGy przy użyciu naświetlacza cezowego (23). Dwadzieścia cztery godziny po napromieniowaniu, dawka komórek 8. 10 x 106 komórek od heterozygotycznych myszy 2bF8trans w objętości 200. 300. L / mysz była infuzowana przez wstrzyknięcie pozorne. Odbiorców analizowano po pozostawieniu 3 tygodni do rekonstytucji szpiku kostnego. Po 4 miesiącach przeprowadzono sekwencyjną BMT od tych przeszczepionych myszy do dodatkowych napromieniowanych myszy FVIIInull. Jako kontrolę, komórki jednojądrzaste szpiku kostnego od myszy FVIIInull przeszczepiono do napromienianych śmiertelnie ściółki z tą samą dawką komórek. Ocena skuteczności FVIII pochodzącego z płytek krwi w obecności przeciwciał hamujących anty-FVIII
[podobne: zss kolbuszowa dolna, redukcja tkanki tłuszczowej dieta, zst kolbuszowa ]
[przypisy: zss kolbuszowa dolna, instytucje zajmujące się pomocą dla młodzieży z problemami rodzinnymi, niepokój manipulacyjny ]