Czynnik VIII, który jest ektopowo ukierunkowany na płytki, jest terapeutyczny w hemofilii A z przeciwciałami hamującymi o wysokim mianie ad

Wytworzyliśmy transgeniczne myszy eksprymujące ludzki FVIII z usuniętą domeną B (hBDDFVIII) z użyciem wstawki PvuI / BsmBI o wielkości 7,6 kb konstruktu hBDDFVIII (2bF8) ludzkiego promotora | 3 | 3b (Figura 1A). Przekazano transmisję zarodkową i potomstwo transgeniczne krzyżowano z myszami FVIIInull, aby wytworzyć myszy, które eksprymują transgen 2bF8 bez ekspresji prawidłowego mysiego FVIII (myszy 2bF8trans). Pojedyncze miejsce insercji transgenu 2bF8 określono metodą PCR z chodzeniem DNA i wykazano, że sekwencja flankująca transgen 2bF8 była identyczna z BAC RP23-127 B9 umiejscowioną w paśmie B1 chromosomu 18. Miejsce integracji, pomiędzy zasadami 4667 i 4668 tego BAC klon, jest w sekwencji powtórzeń typu PB1D10 (Figura 1A). Figura Konstrukcja transgenu 2bF8, jak również analiza miejsca genetycznego i integracji. (A) Schemat ideowy konstruktu transgenu i miejsce wstawienia. Konstruuje się kasetę 2bF8 (od 5 do 3 p): promotor ludzkiego GPIIb (A IIbpr), chimeryczny intron, hBDDFVIII, SV40 poli A i oporność na neomycynę. Wstawienie transgenu 2bF8 znajdowało się w paśmie B1 chromosomu 18. (B) Analiza PCR wykazała, że transgen 2bF8 wykryto u myszy 2bF8trans i FVIIInull po otrzymaniu BMT z myszy 2bF8trans i 3 tygodni. rekonstytucja. Ścieżka 1, marker DNA; ścieżka 2, WT; ścieżka 3, FVIIInull; ścieżka 4, 2bF8trans; ścieżka 5, FVIIInull po BMT (biorcy); ścieżka 6, H20; ścieżka 7, wektor 2bF8. DNA oczyszczono z krwi obwodowej i transgen amplifikowano za pomocą starterów PI i P2 (lewy panel, patrz Tabela 1). Mysi ekson FVIII (mFVIII), który nie ulega zakłóceniu u myszy FVIIInull, amplifikowano jako kontrolę wewnętrzną (prawy panel). Wykazanie specyficznej wobec płytek ekspresji hBDDFVIII. Wykazano, że ludzki promotor | IIb ogranicza ekspresję transgenu do linii płytek krwi (35. 37). Przeprowadzono mikroskopię immunofluorescencyjną w celu potwierdzenia ekspresji rekombinowanego FVIII w płytkach krwi (Figura 2, A (3F). Białko FVIII wykryto w płytkach myszy 2bF8trans i kolokalizowano mysim VWF (Figura 2F). EM dodatkowo potwierdził, że FVIII jest przechowywany razem z VWF w (3-graniach w płytkach krwi myszy 2bF8rans (Figura 2, I. K). FVIII był nieobecny w płytkach krwi myszy kontrolnych FVIIInull, chociaż zaobserwowano prawidłową dystrybucję VWF (Figura 2, A (C, G i H). Przeciwnie, FVIII nie wykryto w komórkach jednojądrzastych od myszy transgenicznych za pomocą mikroskopii konfokalnej (Figura 2, L4Q). Podobnie, aktywność FVIII (FVIII: C) nie została wykryta w lizatach komórek jednojądrzastych od myszy 2bF8trans, WT lub FVIIInull (Figura 2R). Ponadto ekspresja swoistą dla płytek utrzymywała się po przeszczepie szpiku kostnego (BMT) myszy FVIIInull ze szpiku kostnego 2bF8trans (patrz poniżej). Figura 2 Ekspresja FVIII specyficzna dla płytek. (A (3F) Lokalizacja ekspresji białka transgenu została określona za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Izolowane płytki z myszy FVIIInull (A. C) i 2bF8trans (D. F) były wybarwione immunologicznie dla ludzkiego FVIII (hFVIII, A i D) lub mysiego VWF (B i E). Te dwa obrazy połączono w C i F, pokazując, że w płytkach myszy 2bF8trans (F) VWF i FVIII były kolokalizowane (żółte). (G. K) Kolokalizację ludzkiego FVIII i mysiego VWF potwierdzono za pomocą mikroskopii elektronowej. Izolowane płytki z myszy FVIIInull (G i H) i myszy 2bF8trans (I. K) zostały wybarwione immunologicznie dla ludzkiego i mysiego VWF. FVIII sondowano za pomocą 5 nm koloidalnego złota i VWF z 10 nm koloidalnym złotem; Reprezentatywne cząsteczki złota są oznaczone odpowiednio strzałkami i strzałkami. Wyniki pokazują, że FVIII przechowywano razem z VWF w płytkach p-granul u myszy 2bF8trans (I. K). (L. Q) Mikroskopia konfokalna nie wykryła żadnego ludzkiego FVIII w jednojądrzastych komórkach z myszy transgenicznych. Izolowane płytki i komórki jednojądrzaste z myszy 2bF8trans zostały wybarwione immunologicznie dla ludzkiego FVIII. Niespecyficzne izotypowe pierwszorzędowe Ab zastosowano do barwienia tła. (R) Ilościowa ocena poziomów FVIII: C w lizatach komórek jednojądrzastych myszy. Płytki krwi i jednojądrzaste komórki izolowano i poddawano lizie w 0,5% CHAPS. FVIII: C w lizatach oznaczono za pomocą testu chromogennego. Nie wykryto FVIII: C w lizatach komórek jednojądrzastych od myszy 2bF8trans lub kontrolnych (tj. Myszy WT i FVIIInull). FVIII: C wykryto w lizatach płytek krwi myszy 2bF8trans. Skalowane pręty: 8 m (A (F i L, Q); 0,2 m (G. K). Lokalizacja płytek ekspresji transgenu i jego powiększenie przez VWF. Funkcjonalny FVIII: C mierzono w osoczu myszy iw lizatach płytek krwi. FVIII: C zmierzony w osoczu myszy WT wynosił 1,20. 0,12 U / ml, gdy testowano przeciwko rekombinowanemu standardowi hBDDFVIII (rhBDDFVIII)
[przypisy: polskie towarzystwo ultrasonograficzne, przychodnia ożarów mazowiecki, kalendarz triathlon 2015 ]
[więcej w: zdrowe odżywianie dzieci, syrop tymiankowy złożony, narodowy fundusz zdrowia w łodzi ]