Czynnik VIII, który jest ektopowo ukierunkowany na płytki, jest terapeutyczny w hemofilii A z przeciwciałami hamującymi o wysokim mianie cd

Osoczowy FVIII: C był niewykrywalny u myszy FVIIInull, zgodnie z oczekiwaniami; jednak nie wykryto go również w osoczu myszy 2bF8trans (Figura 3A). FVIII normalnie nie ulega ekspresji w płytkach krwi. FVIII: C był funkcjonalny po dodaniu do lizatu płytek krwi WT (Figura 3B), ale nie został wykryty w lizacie płytek krwi od myszy kontrolnych WT lub FVIIInull (Figura 2R i Figura 3C). Jednak funkcjonalny FVIII: C wykryto w lizatach płytek krwi myszy 2bF8trans przy 0,74. 0,13 mU / 108 płytek krwi w heterozygotach (2bF8tg + / a) i 1,41. 0,25 mU / 108 płytek krwi u myszy homozygotycznych (2bF8tg + / +) 2bF8rans (Figura 3C). Zakładając, że objętość osocza wynosi 50% pełnej krwi, a liczba płytek krwi wynosi × 109 / ml, te ilości płytek FVIII odpowiadałyby odpowiednio około 1,23% i 2,35% FVIII: C w pełnej krwi normalnych myszy . Granica wykrywalności tego testu wynosiła 0,07 mU / 108 płytek krwi. Alternatywnie, zmagazynowany FVIII można zmierzyć po indukowanej przez agonistę aktywacji płytek krwi (adrenalina, ADP i peptyd aktywacyjny receptora trombiny). Kwota uwolniona, 0,61. 0,18 mU FVIII: płytki C / 108, było podobne do ilości zmierzonej w 2bF8 trans-płytkowym lizacie. Figura 3 Pochodzący od płytek FVIII może funkcjonować w hemostazie. (A) Ilościowa ocena poziomów FVIII: C w mysim osoczu za pomocą testu chromogennego. Nie wykryto FVIII: C w osoczu myszy FVIIInull i 2bF8trans. (B) Lizat płytek krwi dodany do rozcieńczeń czynnika VIII nie zmienił poziomu FVIII: C zmierzonego za pomocą testu chromogennego. (C) Ilościowa ocena poziomów FVIII: C w lizatach płytek krwi myszy. Płytki izolowano i poddawano lizie w 0,5% CHAPS. FVIII: C w lizatach oznaczono ilościowo za pomocą testu chromogennego. FVIII: C wykryto w lizatach płytek krwi myszy 2bF8trans i biorców szpiku z 2bF8tg + / r. myszy. Liczba płytek FVIII: C była znacząco zwiększona u myszy 2bF8tg + / + w porównaniu z 2bF8tg + /. myszy. FVIII: C było znacząco zmniejszone u myszy 2bF8transVWFnull. * P <0,001. (D) Test przetrwania klatki ogonowej oceniający fenotypową korektę myszy hemofilii A. Wszystkie myszy 2bF8trans i ich biorcy szpiku kostnego przeżyli obcinanie ogona. (E) Test przeżycia ogona ogonowego oceniający korzystny wpływ transgenicznych płytek krwi. Różne proporcje przemytych płytek krwi przetaczano myszom FVIIInull, po czym następowało przycinanie ogonów. Wszystkie myszy FVIIInull, którym podano 2bF8tg + /. płytki krwi do końcowego poziomu 30% wszystkich płytek krwi przetrwały przycinanie ogona. Ponieważ VWF w osoczu jest wymagany do utrzymania prawidłowych poziomów FVIII w osoczu, ustaliliśmy, czy VWF był podobnie wymagany do utrzymania transgenicznego FVIII w płytkach krwi. Transgen 2bF8 został wyhodowany na myszy z niedoborem VWF (VWFnull), tak że transgen 2bF8 ulegał ekspresji na podłożu z podwójnym knock-outem (FVIIInullVWFnull). Stwierdzono, że poziomy płytek krwi FVIII: C były znacząco zmniejszone u myszy 2bF8transVWFnull w porównaniu z myszami 2bF8transVWF + / + (2bF8tg + / . VWFnull, 0,39 0.1 0,18 mU / 108 płytek krwi, 2bF8tg + / + VWFnull, 0,81 . 0,22 mU / 108 płytek krwi, p <0,001, Figura 3C). Podczas gdy czynność płytek krwi FVIII była wyrażana w nieobecności VWF, obecność płytek krwi VWF albo zwiększała przechowywanie, albo chroniła FVIII, powodując wyższe poziomy FVIII: C w płytkach krwi. Te wyniki pokazują, że transgen FVIII kierowany przez promotor a IIb jest obecny w płytkach krwi, jest funkcjonalny, jest wzmacniany przez VWF i jest uwalniany po aktywacji płytek, ale nie daje mierzalnych poziomów w osoczu myszy. Płytki krwi eksprymujące hBDDFVIII korygują fenotyp krwawienia u myszy FVIIInull. Myszy eksprymujące transgen 2bF8 w płytkach krwi, ale pozbawione endogennego mysiego FVIII testowano pod kątem korekcji fenotypu hemofilii A. Aby ocenić korektę defektu krzepnięcia FVIIInull, określiliśmy zdolność do skrzepnięcia i przeżycia po wywołaniu niewielkiej rany poprzez obcinanie ogona. Wszystkie 18 myszy 2bF8trans przeżyło test ogona ogonowego, podczas gdy żadna z dziewięciu myszy FVIIInull nie była zdolna do skrzepnięcia i przetrwania obcinania ogona (Figura 3D). W celu potwierdzenia, że korzyść z ekspresji 2bF8 znajduje się tylko w komórkach hematopoetycznych, komórki jednojądrzaste szpiku kostnego od heterozygotycznych myszy 2bF8trans przeniesiono do letalnych napromieniowanych myszy FVIIInull. Trzy tygodnie po transplantacji obecność transgenu 2bF8 u biorców potwierdzono przez PCR (Figura 1B). FVIII: C nie było wykrywalne w osoczu biorców, ale 0,72. W lizatach płytek krwi mierzono 0,12 mU / 108 płytek krwi. Nie było istotnej różnicy między FVIII: C w lizatach płytek od biorców i dawców (p = 0,73, rysunek 3C) [patrz też: mleko z biedronki wycofane, narodowy fundusz zdrowia w łodzi, uzasadnienie wydłużenia etapu edukacyjnego ] [przypisy: przychodnia ożarów mazowiecki, badanie kału na pasożyty, polskie towarzystwo ultrasonograficzne ]