Hamowanie nefropatii cukrzycowej przez peptyd wabika odpowiadający uchwytowi region dla nieprololitycznej aktywacji proreniny ad 7

Wyniki te sugerują, że aktywność reniny wewnątrznerkowej wzrasta podczas rozwoju nefropatii cukrzycowej i że nieproteolityczna aktywacja proreniny znacząco przyczynia się do zwiększenia aktywności reniny wewnątrznerkowej. Powód, dla którego nieproteolityczna aktywacja proreniny występuje w narządu cukrzycowym pozostaje niejasna. Uważamy jednak, że obecne badania stanowią wiarygodne wyjaśnienie. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami in vitro i in vivo (22, 23) poziomy mRNA katepsyny B nerki znacząco zmniejszyły się podczas rozwoju nefropatii cukrzycowej (Figura 7D). Wynik ten sugeruje, że zmniejszone przetwarzanie proreninu może zwiększać stosunek proreniny do reniny w nerkowych nerkowych szczurach. W rzeczywistości, immunohistochemiczne zabarwienie proreniny znacząco wzrosło w nerkowych nerkowych nerkach szczura w porównaniu z kontrolnymi nerkami szczura (Figura 8, A i B), chociaż całkowita zawartość reniny nerek cukrzycowej szczura była podobna lub niższa niż nerki kontrolnej szczura (Figura 6C). ). Ponieważ zarówno renina, jak i prorenina konkurencyjnie wiążą się z receptorem renina / prorenina (9), względny wzrost proreniny w porównaniu z reniną może powodować większe wiązanie proreniny z jej receptorem, co prowadzi do nieprobotolitycznej aktywacji proreniny. Pomysł ten został potwierdzony przez wynik niniejszego badania, pokazujący, że hamowanie nieprololitycznej aktywacji proreniny przez HRP znacząco hamuje zwiększone barwienie immunohistochemiczne narażonego aktywnego centrum reniny / proreniny w nerkach szczurów z cukrzycą (Figura 8, A i C) . Alternatywnie, nieproteolityczne aktywatory proreninowe, takie jak receptor renina / prorenina (9) lub ich powinowactwo do proreniny mogą być zwiększone w narządu cukrzycowym. Konieczne będą dalsze badania w celu ustalenia przyczyny, dla której nieproteolityczna aktywacja proreniny zachodzi w narządu cukrzycowego. Podsumowując, nawet jeśli zwierzęta z cukrzycą mają wysoki poziom proreniny w osoczu i niskie poziomy reniny w osoczu, co sugeruje stłumiony krążący RAS (1), blokery receptorów Ang II typu mają korzystny wpływ w zapobieganiu rozwojowi i postępowi uszkodzenia narządu cukrzycowego (24, 25). Badanie to wyraźnie wykazało, że rozwój nefropatii cukrzycowej jest związany z aktywowanym nerkowym RAS i zasugerował, że nieproteolityczna aktywacja proreniny znacząco przyczynia się do aktywacji nerkowego RAS i rozwoju nefropatii cukrzycowej. Dlatego proponujemy, aby substancje hamujące nie proteolityczną aktywację proreniny, takie jak HRP, były przydatne w strategiach terapii lekowej, aby zapobiec uszkodzeniu narządu cukrzycowego. Metody Przygotowanie szczurzego peptydu o działaniu proreniny i jego Ab. Rycina pokazuje prosegment szczura proreniny. Aby pokryć region uchwytu (pozycja 11-15) (5), zaprojektowaliśmy dekapeptyd, NH2-RILLKKMPSV-COOH, jako HRP szczurzej proreniny i oczyszczono go metodą HPLC na kolumnie z odwróconymi fazami C-18. Czystość i czas retencji w HPLC wynosiły odpowiednio 97,6% i 26,2 minuty. Masa produktu wynosiła 1855,7, podobnie jak teoretyczna masa (1 186,0). Przeciw ABP szczurze HRP hodowano przeciwko peptydowi RILLKKMPSVC sprzężonemu z hemocyjaniną skałoczepa u królików. HRP zastosowano do określenia miana surowicy odpornościowej przy użyciu zestawu Vectastatin ABC-AP królika IgG (Vector Laboratories) i jako ligand kolumny powinowactwa do oczyszczenia Ab. Surowice odpornościowe o wysokim mianie uzyskano 6 tygodni po pierwszej immunizacji. Żel powinowactwa wytworzono przez sprzężenie Biogel 102 (żel sprzężony z aminami, Bio-Rad Laboratories) poprzez resztę cysteiny peptydu antygenowego jako ligand. Ab oczyszczono na kolumnie powinowactwa, a stężenie oczyszczonego Ab (3,90 mg / ml) obliczono stosując współczynnik ekstynkcji 1,35 przy mg / ml IgG i 280 nm. Analiza immunoblotowa. Rekombinowaną szczurzej proreninę i reninę poddano 12% SDS-PAGE i elektroforetycznie przeniesiono na membranę z difluorkiem poliwinylidenu. Renin został przygotowany przez traktowanie proreniny trypsyną; to jest, proreninę inkubowano z 200 .g / ml trypsyny przez 20 minut przy pH 7,4 i 25 ° C, a następnie działanie trypsyny zatrzymano za pomocą mM PMSF. Błonę inkubowano osobno z króliczą anty-szczurzym surowicą reninową reninową (1: 1000) (26) i oczyszczonym 3 nM króliczym peptydem z króliczą antyludzkości Ab przez godzinę w temperaturze pokojowej pod nieobecność lub przy obecności 10, 100 i 1000 nM. regionalne peptydy prosegmentu prorenin. Po przemyciu immunokompleks na tych arkuszach wizualizowano stosując sprzężone z peroksydazą chrzanową drugorzędowe anty-królicze IgG i diaminobenzydynę. Zwierząt. My utrzymywaliśmy samce szczurów Sprague-Dawley (Charles River Laboratories Inc.) w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, które utrzymywano w temperaturze 23 ° C i 12-godzinnym cyklu światła / 12-godzinnej ciemności, z wolnym dostępem do wody i normalnej soli. dietetyczna karma dla szczurów (0,4% NaCl) (CE-2, Nihon Clea)
[podobne: badanie kału na pasożyty, wirusowe zapalenie krtani, uzasadnienie wydłużenia etapu edukacyjnego ]
[więcej w: redukcja tkanki tłuszczowej dieta, szkoła rodzenia madalińskiego, mleko z biedronki wycofane ]