Hamowanie nefropatii cukrzycowej przez peptyd wabika odpowiadający uchwytowi region dla nieprololitycznej aktywacji proreniny ad 8

Komitet Keio University ds. Opieki nad zwierzętami zatwierdził wszystkie protokoły eksperymentalne. W wieku 3 tygodni, pod znieczuleniem pentobarbitalem sodu (50 mg / kg ip), usunęliśmy lewą nerkę ze 100 do 150-gramowych szczurów i podzieliliśmy szczury z heminnizacją na cztery grupy: C, C + HRP, DM i Grupy DM + HRP. Szczury z cukrzycą otrzymywały ip 10 mM buforu cytrynianowego z 65 mg / kg streptozotocyny (Wako Pure Chemical), a szczury z kontrolą bez cukrzycy otrzymywały 10 mM bufor cytrynianowy sam w 4 tygodniu życia. Co 28 dni zmieniliśmy wszczepioną podskórnie minipompę osmotyczną (model 2004, do użytku 28-dniowego, pompy osmotyczne Alzet) zawierającą sól fizjologiczną lub HRP (0,1 mg / kg), i pozbawiliśmy głowy sześć szczurów po 12, 20 i 28 tygodniach wiek, aby uzyskać krew i prawą nerkę każdego zwierzęcia. W naszych badaniach wstępnych wszczepiono również szczurom osmotycznym z NH2-SFGR-COOH (0,1 mg / kg, n = 3) lub NH2-MTRISAE-COOH (0,1 mg / kg, n = 3) u szczurów z cukrzycą. Te peptydy nie hamowały jednak rozwoju stwardnienia kłębuszków nerkowych ani wzrostu poziomu Ang I i II w nerkach szczurów z cukrzycą. Eksperymenty. Mierzono skurczowe ciśnienie tętnicze krwi szczurów w wieku 4, 8, 12, 16, 20, 24 i 28 tygodni za pomocą pletyzmografii ogonowej. 24-godzinny mocz zebrano w klatce metabolicznej, a wydalanie białka i kreatyniny w moczu oznaczono za pomocą zestawu testowego Micro TP (Wako Pure Chemical) i zestawu do testu kreatyniny HA (Wako Pure Chemical), odpowiednio. Krew uzyskano z żyły ogonowej, a glukozę analizowano za pomocą zestawu testowego glukozy C (Wako Pure Chemical). Ocena morfologiczna i immunohistochemiczna. Część nerki usuniętej z każdego zwierzęcia utrwalono w 10% formalinie w buforze fosforanowym (pH 7,4). Skrawki osadzone w parafinie zabarwiono metodą PAS. Określiliśmy ilościowo całkowitą powierzchnię stwardnienia w obrębie kłębków kłębuszków nerkowych, stosując półilościowy system oceny zaproponowany przez El-Nahas i in. (27). Dla każdego zwierzęcia uzyskano wskaźnik kłębuszków nerkowych, badając 100 kłębuszków w powiększeniu x 400. Nasilenie stwardnienia kłębków nerkowych wyrażano w arbitralnej skali od 0 do 4: stopień 0, normalne kłębuszki; stopień 1, obecność ekspansji mezangialnej / zgrubienia błony podstawnej; stopnia 2, łagodna do umiarkowanej częściowej hyalinosis / stwardnienie obejmujące mniej niż 50% kłębków kłębuszków; stopień 3, rozproszona kłębuszkowa hyalinoza / stwardnienie obejmujące ponad 50% pęczków; stopień 4, rozproszona stwardnienie kłębków nerkowych z całkowitym obliteracją i zapaścią pęczków. Wynikowy wskaźnik dla każdego zwierzęcia wyrażono jako średnią wszystkich uzyskanych ocen. W celu barwienia immunohistochemicznego, skrawki poddane deparafinacji traktowano uprzednio proteinazą K, skrawki następnie gotowano w buforze cytrynianowym za pomocą mikrofal w celu zdemaskowania miejsc antygenowych, a endogenną biotynę blokowano układem blokującym biotynę (X0590; DAKO Corp.). Następnie sekcje zanurzono w 3% H2O2 w metanolu, aby zahamować endogenną peroksydazę, a następnie wstępnie powleczono 1% mlekiem niesączkowatym w PBS w celu zablokowania nieswoistego wiązania. W przypadku barwienia immunohistochemicznego kolagenu typu IV i proreniny, koktajl króliczych przeciwciał poliklonalnych do łańcuchów anty a a2 (IV), a4 (IV) i -a5 (IV) kolagenu typu IV (1: 400; R. Kalluriego, Center for Matrix Biology, Beth Israel Deaconess Medical Center) (28) i króliczego anty-szczurzego HRP Ab zastosowano odpowiednio do sekcji jako pierwszorzędowy Ab. Skrawki inkubowano ze skoniugowanym z biotyną anty-króliczym IgG jako drugorzędowym Ab. W przypadku barwienia immunohistochemicznego wyeksponowanego aktywnego centrum reniny na sekcje zastosowano pierwotną Ab z kozim poliklonalnym Ab do szczurzego reniny, który reaguje krzyżowo z proretyną aktywowaną nie proteolitycznie, ale nie z naturalną proreniną (1: 1,000) (26, 29, 30). . Skrawki inkubowano ze skoniugowanym z biotyną anty-kozim IgG jako drugorzędowym Ab. Reakcje Ab były wizualizowane przy użyciu zestawu VectaStain ABC Standard Kit (Vector Laboratories) i standardowego zestawu AEC (DAKO Corp.) według producentów. instrukcje. Określiliśmy ilościowo immunoreaktywny obszar kolagenopodobny typu IV w każdym kłębuszku przy powiększeniu x 200 za pomocą Mac SCOPE (wersja 2.5, Mitani Corp.) i wyrażono go jako procent całej powierzchni przekroju kłębuszka. Poziomy proreniny i eksponowanego aktywnego centrum reniny oceniano przez zliczenie liczby komórek przykłębuszkowych, w których intensywność sygnału produktów reakcji była powyżej poziomu widzialnego. Końcowy wynik ogólny obliczono jako średnią wartości dla 100 kłębuszków na grupę szczurów. Pomiary peptydów reninowych i Ang
[podobne: przychodnia ożarów mazowiecki, sok z buraka właściwości, niepokój manipulacyjny ]
[podobne: suplementy na wypadanie włosów, zst kolbuszowa, kolbuszowa dolna ]