Homeostaza ciśnienia krwi jest utrzymywana przez P311 TGF- oś ad 7

Dane z WT i P311. /. myszy zbierano przez okres tygodnia i analizowano za pomocą oprogramowania Dataquest ART (dostarczonego przez Data Sciences International). Pletyzmograficzne ciśnienie krwi rejestrowano za pomocą 8-kanałowego nieinwazyjnego systemu pobierania krwi CODA (Kent Scientific) zgodnie z protokołem producenta. Myszy umieszczono w przezroczystym akrylowym ograniczniku z wbudowanym stożkiem nosowym przez co najmniej 30 minut przed uzyskaniem pomiarów ciśnienia. Rejestrowano skurczowe, rozkurczowe i średnie ciśnienie krwi oraz częstość akcji serca. Ciśnienie krwi monitorowano w dniach 0, 3, 6 i 10 TGF-a. badania leczenia. Echokardiografia. Echokardiografię przezklatkową wykonano u obudzonych i znieczulonych myszy przy użyciu układu dopplerowskiego (Acuson c256) wyposażonego w 15-MHz przetwornik liniowy (15L-8) (43). Serce zostało najpierw zobrazowane w trybie 2D w projekcji przymostkowej w osi długiej, w celu pomiaru grubości ściany i wymiarów komory, a także wymiaru aorty. Pole przekroju LV przy końcu diastolu i skurczu mierzono na dwuwymiarowym widoku mięśni brodawkowatych 2D. Uzyskano również następujące parametry: (a) wymiary komory LV; (b) grubość ściany NN; (c) masa LV (LVM); (d) frakcja wyrzutowa LV (LVEF); (e) frakcja skracająca; (f) pojemność minutowa serca; oraz (g) wymiary aorty. Podawanie rekombinowanych TGF-ys. Myszy wstrzyknięto dootrzewnowo rekombinowanemu (r) ludzkiemu TGF-pi, rTGF-a2, rTGF-a3 lub rTGF-a 1-3 (R & D Systems). Zastrzyki podawano myszom raz dziennie przez 10 dni w dawce 250 ng (rTGF-pi, rTGF-a 2 i rTGF-a3) lub 100 ng każdego (rTGF-a 1-3). Przed i po rTGF-. leczenia, monitorowano ciśnienie krwi i wykonywano echokardiografię (tylko w przypadku skojarzonego leczenia rTGF-a 1-3). Po 10 dniach leczenia aorty zostały wyizolowane do badań myograficznych wraz z analizą Western blot lub ELISA (patrz poniżej). Wire myography. Aorty piersiowe i tętnice oporne na krezkę pocięto na pierścienie o długości około 2 mm, a kurczliwość zmierzono za pomocą systemu DMD 610M z wieloma miografami (DMT-USA Inc.). Początkowo zastosowano optymalne napięcie, a tkanki pozostawiono do osiągnięcia równowagi przez godzinę w 5 ml roztworu soli fizjologicznej (PSS; zawiera 118,99 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 4,69 mM KCl, 1,18 mM KH2P04, 1,17 mM MgS04, 2,5 mM CaCI2, 0,03 mM EDTA i 5,5 mM glukozy) w 37 ° C, delikatnie pompowanej mieszaniną gazów o zawartości 95% O2 i 5% CO2. Dla TGF-. W leczeniu inhibitora receptora wykorzystano PSS zawierający 100 .M LY364947 (Sigma-Aldrich). Skurcze aorty i tętnic określano po kolejnym dodawaniu KCl, czynników zwężających naczynia (noradrenaliny, fenylefryny, epinefryny i angiotensyny II, Sigma-Aldrich) lub wazodylatatora (hydralazyna, Sigma-Aldrich) do buforu PSS. Ciśnieniowa myografia. Tętnice oporne na krezkę (o średnicy 100 – 150 .m) zostały rozcięte w buforze PSS i zamontowane na mykoprografie ciśnieniowym DMT 110P (DMT-USA Inc.). Ton mięśniowy oceniano przez poddanie tętnic serii stopni nacisku (10. 125 mmHg) i rejestrowano średnice światła. Aktywne i pasywne średnice oznaczano odpowiednio w buforze PSS (zawierającym 2,5 mM CaCl2) lub wolnym od Ca2 + buforze PSS (zawierającym 2 mM EGTA). Ton mięśniowy obliczono jako procentowe zwężenie w stosunku do pasywnej średnicy światła przy każdym odpowiednim ciśnieniu transmuralnym: ([sasiemcząca średnica <średnica czynna] / średnica) x 100. Zastosowano ciśnienie pośrednie (75 mmHg) do określenia odpowiedzi tętnic na K +. Test aktywności RhoA. Związany z GTP (tj. Aktywny) RhoA został wyizolowany z aort przy użyciu komercyjnego zestawu (Millipore). Aorty z WT i P311. /. myszy lizowano buforem do lizy wiążącym Rho (50 mM Tris, pH 7,2, 1% Triton X-100, 0,5% dezoksycholanu sodu, 0,1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl2 z 10 .g / ml leupeptyny, 10 .M; g / ml aprotyniny i mM PMSF). Lizaty sklarowano przez odwirowanie, a aktywny RhoA strącono za pomocą perełek agarozowych sprzężonych z 20 .g białka fuzyjnego znakowanego GST odpowiadającego reszcie 7. 89 mysiej domeny wiążącej rhhotekin. Precypitaty poddano immunoblottingu za pomocą RhoA Ab dostarczonego w zestawie. Lizaty aorty poddawano inkubacji z 100 (3M GTPyS i mM GDP stosowano, odpowiednio, jako kontrole pozytywne i negatywne. Morfometria. Aserowana aorta i tętnice krezkowe z WT i P311. /. myszy utrwalono w formalinie i zatopiono w parafinie. Skrawki a. M od 5. M wybarwiano barwnikiem jądrowym DAPI (5. G / ml w wodzie) przez 10 minut i obserwowano pod mikroskopem Zeiss Axioplan wyposażonym w optykę epifluorescencyjną. Dla każdego pola 2 obrazy zostały pozyskane przez aparat cyfrowy Leica DC500 w celu wizualizacji elastycznej blaszki (autofluorescencji obserwowanej w kanale fluoresceinowym) i jądra (obserwowane przy użyciu zestawu filtrów UV) [hasła pokrewne: badanie kału na pasożyty, niepokój manipulacyjny, szkoła rodzenia madalińskiego ] [patrz też: uzasadnienie wydłużenia etapu edukacyjnego, zss kolbuszowa dolna, instytucje zajmujące się pomocą dla młodzieży z problemami rodzinnymi ]