Homeostaza ciśnienia krwi jest utrzymywana przez P311 TGF- oś ad 8

Obrazy zostały następnie nałożone za pomocą oprogramowania Leica IM 1000 Image Manager. Długość najbardziej wewnętrznej warstwy elastycznej (IEL) i liczbę jąder zawartych pomiędzy dwiema elastycznymi warstwami w aorcie oraz między wewnętrzną i zewnętrzną elastyczną blaszką w tętnicach krezkowych określono przy pomocy oprogramowania Metamorph (wersja 7.5, Molecular Devices). TGF-. ELISA. Testy ELISA przeprowadzono przy użyciu testu Emax Immuno (Promega) ze zmodyfikowanymi protokołami dla świeżych tkanek aorty i surowicy. MAb TGF- | 3l (dostarczone w zestawie), mAb TGF-a2 (MAB612; R & D Systems) i mAb TGF-A3 (MAB643; R & D Systems) opłaszczono na 96-studzienkowej płytce i inkubowano przez noc w 4 ° C. DO. Po zablokowaniu, TGF-. Wzorce białkowe i zakwaszone lub nie-zakwaszone próbki surowicy (odpowiednio, aby pokazać całkowite lub aktywne TGF-ys) pozostawiono do związania w temperaturze pokojowej na 1,5 godziny. Wtórny Abs. TGF-P poliklonalny Ab (pAb) (dostarczony w zestawie), TGF-a2 pAb (BAF302; R & D Systems) i TGF-a3 pAb (BAF243; R & D Systems). zostały dodane w celu uzupełnienia kanapki, a następnie chromogennego substratu 3,3., 5,5. -tetrametylobenzydyny (TMB), roztworu zatrzymującego (1N HCl) i zapisu absorbancji przy 450 nm. IHC. IHC przeprowadzono w University of Chicago Pathology Core Facility. Procedura immunoperoksydazy została zastosowana do aortów utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie z WT i P311. /. myszy i utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie tkanki ludzkie. Skrawki tkanek 5. M inkubowano z przeciwciałem przeciwko mysiemu P311 (rozcieńczenie 1:50, pozycja 44), przeciwciałem przeciwko ludzkiemu P311 (rozcieńczenie 1:50, odnośnik 45), anty-TGF-a1-3 Ab (Rozcieńczenie 1:20, MAB1835, R & D Systems) lub anty-Smad2 / 3 Ab (rozcieńczenie 1:50, sc-6033, Santa Cruz) po demaskowaniu antygenu przez gotowanie w świeżym buforze cytrynianowym, a reakcje opracowano za pomocą zestawu Vectastain ABC ( Laboratoria wektorowe). Oznaczenia intensywności wykonano w warstwie mięśniowej ludzkiej tętnicy w 6 równoodległych punktach. Dane IHC przekształcono na obrazy 8-bitowe, a densytometrię przeprowadzono przy użyciu Image J (wersja 1.41x, NIH). Kultura VSMC. Wyizolowane aorty zostały pozbawione warstwy przydankowej za pomocą mikrodysekcji i komórek śródbłonka poprzez przejście przez sterylną końcówkę pipety i utrzymywanie w roztworze Fungizone (Invitrogen) przez 2. 3 min. Aorty pocięto na małe kawałki i inkubowano w 100 ul roztworu enzymu kolagenazy II (1,5 mg / ml) w 37 ° C przez 5 godzin. VSMC zostały następnie uwolnione z trawionych tkanek poprzez pipetowanie w górę iw dół przez końcówkę. Uwolnione komórki przemyto trzy razy w PBS, ponownie zawieszono w pożywce hodowlanej DMEM z 10% FBS i wysiano na płytki. VSMC stosowano w 1. pasażu, izolacji RNA i PCR w czasie rzeczywistym. Izolację RNA i syntezę cDNA wykonywano z tkankami aorty i hodowanymi VSMC z aorty stosując TRIzol (Invitrogen) i zestaw do syntezy cDNA iScript (Bio-Rad). Real-time PCR dla mysiego cDNA przeprowadzono przy użyciu iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) i następujących starterów: sens Tgfb1, 5a-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3; Antysensowny Tgfb1, 5 (3 -TTCTCTGTGGAGCTGAAGCA-3; Sens Tgfb2, 5 (3-GTGACATGGACAGTGGATGC-3; Antysensowny Tgfb2, 5 (3-GCGGACGATTCTGAAGTAGG-3; Sens Tgfb3, 5a-TGGAGTCATGGCTGTAACT-3 .; Antysensowny Tgfb3, 5C-CACTCACACTGGCAAGTAGT-3; Gapdh sense, 5 (3 -ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3; Antysensowny Gapdh, 5a-GCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3 .. Do wykrywania mRNA P311 z aort ludzkich wykorzystano następujące startery: sensowny, 5a-TCCAAACAAGGACATGGAGGG-3; antysensowny, 5 (3 -AGGTAACTGATTCTTGGGGAG-3 .. Transfekcja P311 i test reporterowy. W przypadku przejściowych transfekcji VSMC z konfluencją w przybliżeniu 70% transfekowano konstruktem ekspresyjnym P311 pCMV-Myc-P311 (Clontech), stosując odczynnik Lipofectamine 2000 w Opti-MEM (Invitrogen). W 24 godziny po transfekcji komórki trypsynizowano i stosowano do badań kurczliwości żelu (patrz poniżej). W celu przeprowadzenia testu reporterowego, regiony TGF-a1-3-5 (3 i 3 y -UTR wklonowano do wektora lucyferazy świetlika promotora pGL3 (Promega) w celu wygenerowania konstruktów reporterowych. P311. /. mysie VSMC wysiano na 6-studzienkowe płytki i transfekowano wektorem ekspresyjnym P311, konstruktami reporterowymi i wektorem kontrolnym lucyferazy renilla pRL-SV40. 48 godzin po kotransfekcji stosowano system podwójnego reportera lucyferazy (Promega) w celu określenia stosunku aktywności lucyferazy świetlika / renilla, jak wskazał producent. Immunoprecypitacja RNA. 48 godzin po transfekcji konstruktem ekspresyjnym P311 pCMV-Myc-P311 lub pustym wektorem, komórki poddano lizie w buforze do lizy (25 mM Tris, 150 mM NaCl, mM EDTA, 1% NP-40, 5% glicerol, pH 7,4) dostarczane z koktajlem inhibitora proteazy Halt (Thermo Scientific). Lizaty komórkowe poddawano immunoprecypitacji stosując agarozę anty-c-Myc (A7470; Sigma-Aldrich).
[więcej w: syrop tymiankowy złożony, zss kolbuszowa dolna, wydłużenie etapu edukacyjnego uzasadnienie ]
[podobne: niepokój manipulacyjny, wirusowe zapalenie krtani, zdrowe odżywianie dzieci ]