Patologia zależna od androgenów demonstruje miopatyczny wkład w fenotyp choroby Kennedyego w modelu myszy typu knock-in ad 9

Lizat próbki o wadze 2 mg oczyszczono przez inkubację z kulkami agarozowymi białka A / G w 4 ° C przez 10 minut. Supernatant zebrano, następnie zmieszano z kulkami agarozowymi sprzężonymi z N-20P i delikatnie kołysano w 4 ° C przez noc. Perełki przemyto dokładnie lodowato zimnym PBS, ponownie zawieszono w 2 x buforze do próbek i gotowano przez 5 minut. Próbki rozdzielono za pomocą 10% SDS-PAGE i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe (Bio-Rad); białka wizualizowano za pomocą chemiluminescencji (PerkinElmer). Immunohistochemia i immunofluorescencja. Tkankę utrwalono w formalinie, zatopiono w parafinie, podzielono na 5 urn i wybarwiono H & E. W przypadku immunohistochemii na utrwalonej tkance, odzyskiwanie antygenu osiągnięto przez wstępne potraktowanie kwasem mrówkowym przez 10 minut, następnie gotowanie w buforze glicynowym (pH 3,5) przez 10 minut. Skrawki tkanki barwiono przeciwciałami przeciw AR (Santa Cruz Biotechnology Inc.) lub ekspandowanym szlakom glutaminowym (1C2; Chemicon International). Białka wizualizowano za pomocą zestawu Vectastain ABC (Vector Laboratories). Lekkie obrazy zostały wykonane przy użyciu mikroskopu Olympus BX41, obiektywu × 40 i aparatu cyfrowego SPOT Insight (Diagnostic Instruments). W celu wizualizacji CLCN1, 10. M zamrożonych skrawków barwiono przeciwciałem specyficznym dla CLCN1 (Alpha Diagnostic International) i drugorzędowym przeciwciałem Alexa Fluor 594 (Invitrogen). Obrazy konfokalne przechwytywano przy użyciu mikroskopu Zeiss LSM 510 i soczewki zanurzonej w wodzie (x 63). Analiza ekspresji genów. Całkowity RNA wyizolowany z tkanek za pomocą Tri zol (Invitrogen) służył jako matryca do syntezy cDNA przy użyciu zestawu cDNA Archive High Capacity firmy Applied Biosystems. Startery specyficzne dla genu i sondy znakowane fluorescencyjnym barwnikiem i wygaszaczem reporterowym zakupiono w Applied Biosystems. Testy TaqMan przeprowadzono przy użyciu 5 ng alikwotów cDNA. Replikowane probówki analizowano pod kątem ekspresji rybosomalnego RNA 18s (rRNA) przy użyciu sondy znakowanej VIC. Wartości cyklu progowego (Ct) oznaczono za pomocą ABI Prism 7900HT Sequence Detection System, a względne poziomy ekspresji obliczono za pomocą standardowej metody analizy krzywej. Pomiar poziomu testosteronu w surowicy. Stężenie testosteronu w surowicy oznaczano za pomocą testu radioimmunologicznego (Diagnostic Systems Laboratories), który miał czułość 0,05 ng / ml. Referencyjny preparat testosteronu, otrzymany z Steraloids Inc., oczyszczono za pomocą HPLC i zweryfikowano metodą chromatografii cienkowarstwowej i testu immunologicznego. Elektromiografia. Myszy znieczulono izofluranem, a mięśnie dźwigacza odbytu / cebulkowatego i mięśnie kończyn tylnych odsłonięto chirurgicznie. Pomiary inwentaryzacji i spontanicznej elektromiografii uzyskano z każdego mięśnia za pomocą koncentrycznej elektrody igły o wymiarach 30 (25 mm x 0,30 mm). Postępy w wykonywaniu igieł zostały wykonane w co najmniej 4 kierunkach dla każdego mięśnia. Czas trwania aktywności insercyjnej mierzono w krokach 100 ms (10 ms / dz) z wzmocnieniem ustawionym na 50. V na interwał. Ustawienia filtra dolno- i górnoprzepustowego wynosiły odpowiednio 2 Hz i 10 kHz. Dane elektromiografii igłowej zebrano i analizowano za pomocą jednostki Teca TD-20 (Teca Corp.) i rejestrowano za pomocą cyfrowej kamery wideo. Statystyka. Istotność statystyczną oceniano przy użyciu dwustronnego testu ucznia lub ANOVA z testem wielokrotnego porównania Newmana-Keulsa, jak określono przy użyciu pakietu oprogramowania Prism 4 (GraphPad Software). Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za znaczące. Podziękowania Podziękowania dla S. Marc Breedlove i Maurice a Swansona za pomocne dyskusje, Transgeniczny Rdzeń Zwierząt Uniwersytetu Michigan oraz Laboratorium Mikroskopii i Analizy Obrazów w celu uzyskania pomocy w tym projekcie, a Elizabeth Walker za przygotowanie danych liczbowych. Praca ta została wsparta Nagrodą za rozwój kariery Beeson od NIH i Amerykańskiej Federacji na Rzecz Badań nad Starzeniem (K08 AG024758 do AP Lieberman) oraz poprzez granty od NIH (NS045195 do C. Jordan), Departament Obrony (DAMD17-02- 1-0099 do DM Robbins), Stowarzyszenie Dystrofii Mięśni (3393 do AP Lieberman), Stowarzyszenie Chorób Kennedy ego (do AP Lieberman) oraz University of Michigan Nathan Shock Center Rodent Core i Rada Biomedyczna (do AP Lieberman) . Przypisy Niestandardowe skróty: AR, receptor androgenowy; CLCN1, kanał chlorkowy 1; GDNF, czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych; MyoD, myogeniczny antygen różnicujący; NT-4, neurotrofina-4; rRNA, rybosomalne RNA; SCN4A, bramkowany napięciem kanał sodowy, podjednostka a; SOD1, dysmutaza ponadtlenkowa Cu / Zn. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.116: 2663. 2672 (2006). doi: 10.1172 / JCI28773
[przypisy: instytucje zajmujące się pomocą dla młodzieży z problemami rodzinnymi, szkoła rodzenia madalińskiego, niepokój manipulacyjny ]
[patrz też: wydłużenie etapu edukacyjnego uzasadnienie, uzasadnienie wydłużenia etapu edukacyjnego, zss kolbuszowa dolna ]