PPAR ligandy hamują wzrost guza pierwotnego i przerzuty przez hamowanie angiogenezy ad

Guz wycięto w sterylnych warunkach, strawiono kolagenazą i DNazą (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana, USA) i hodowano w pożywce DMEM / F-12 z 20% FBS. Rozyglitazon był dostarczany przez GlaxoSmithKline Pharmaceuticals (King of Prussia, Pennsylvania, USA). Troglitazone był uprzejmie dostarczany przez Parke-Davis (Ann Arbor, Michigan, USA). WY 14643 otrzymano z ChemSyn Laboratories (Lenexa, Kansas, USA). Przygotowanie bFGF. Ludzkiego bFGF (5. -ATGCCCGCCT TGCCCGAGGA TGGCGGCAGC GGCGCCTTCC CGCCCGGCCA CTTCAAGGAC CCCAAGCGGC TGTACTGCAA AAACGGGGGC TTCTTCCTGC GCATCCACCC CGACGGCCGA GTTGACGGGG TCCGGGAGAA GAGCGACCCT CACATCAAGC TACAACTTCA AGCAGAAGAG AGAGGAGTTG TGTCTATCAA AGGAGTGTGT GCTAA-3 ) poddano ekspresji w E. coli. Białko oczyszczono metodą szybkiej chromatografii cieczowej Fast Performance na kolumnie HiTrap Heparin (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, New Jersey, USA). Kolumnę przemyto 0,8 M NaCl, a bFGF eluowano 2 M i 3 M NaCl. Frakcje zawierające czysty bFGF, jak określono za pomocą barwienia srebrem i analizę Western, połączono, zatężono, wyjałowiono i dializowano do 20 mM cytrynianu sodu, mM EDTA, 9% sacharozy, pH 5,0. Analiza cytometrii przepływowej. Zawiesinę komórek nowotworowych (włókniakomięsak T241 lub LLC-GFP) wytworzono przez przepuszczenie żywej tkanki przez sito i traktowanie kolagenazą i DNazą. W celu izolacji komórek śródbłonka skóry zmielono skórę mysią, potraktowano kolagenazą i DNazą w DMEM, homogenizowano i przesączono. Zawiesiny komórkowe znakowano sprzężonym z fikoerytryną przeciwciałem anty-VEGF receptor-2 i przeciwciałem anty-PEGAM / przeciwciało adhezyjne (przeciw-PECAM) (Pharmingen, San Diego, Kalifornia). Milion dodatnich komórek śródbłonka nowotworu i skóry lub komórek GFP-dodatnich LLC zebrano za pomocą FACS. VEGF, bFGF i specyficzny dla prostaty test ELISA na antygen. Komórki nowotworowe wysiano na 15 000 komórek na studzienkę (płytki 6-studzienkowe) i 24 godziny później traktowano rosiglitazonem lub 0,1% DMSO. Pożywkę zawierającą leki zmieniono w dniach 3 i 5. Pożywkę zebrano w dniu 6. VEGF i bFGF w pożywkach testowano za pomocą testu ELISA (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA). Surowicę swoistą dla prostaty (PSA) zmierzono metodą ELISA (Beckman Coulter Inc., Fullerton, California, USA), jak opisano (24). Matrix metaloproteinazy i tkankowy inhibitor aktywności metaloproteinazy. Aktywność żelatynazy w podłożach kontrolnych i komórkach leczonych rosiglitazonem oznaczano za pomocą elektroforezy żelowej podłoża, jak opisano wcześniej (25). Inhibitor tkankowy aktywności metaloproteinazy (TIMP) analizowano przy użyciu zmodyfikowanego testu ilościowej kolagenazy z kolagenem [14C] (26). Analiza Western blot. Po 16 godzinach traktowania, białko wyekstrahowano z 60% zlewnych płytek i wykonano immunoblotting dla PPARa. zgodnie z opisem (5). Pozytywna kontrola dla PPAR. otrzymano z całkowicie zróżnicowanych komórek C3H / 10T 1/2 z cechami adipocytów, co potwierdzono barwieniem czerwienią olejowym. Całkowite ekstrakty białkowe (10-303 g) analizowano na bibule inkubowanych z pierwotnymi (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, California, USA) i przeciwciałami drugorzędowymi (Amersham Biosciences Corp.). Aby przetestować eIF-2. Stan fosforylacji po 30 minutach traktowania, białko ekstrahowano z wykładniczo rosnących HUVEC i przeprowadzono analizę Western blot, jak opisano (12). Immunohistochemia. Chirurgiczne okazy guzów i skóry przetwarzano zgodnie ze standardowym protokołem. Skrawki poddawano działaniu mikrofal w 10 mM cytrynianie sodu (pH 6,0) dla PPARy, vWF, MECA-32 i jądrowego antygenu proliferacyjnego komórek (PCNA) i traktowano 40. G / ml proteinazy K (Roche Diagnostics Corp.) przez 25 minut. w 37 ° C dla PECAM. Mysz przeciw ludzkiemu PPAR. (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA), króliczego antyludzkiego vWF (DAKO Corp., Carpinteria, California, USA), szczurzego anty-mysiego PECAM (Pharmingen), szczurzego anty-mysiego komórek panendotelialnych MECA-32 antygen (Pharmingen) i mysie przeciwciało przeciw ludzkiemu PCNA (DAKO Corp.) inkubowano w 4 ° C przez noc. PECAM, MECA-32 i PPAR. barwniki amplifikowano za pomocą zestawów do bezpośredniej i pośredniej amplifikacji sygnałów tyramidowych (NEN Life Science Products Inc., Boston, Massachusetts, USA). vWF i PCNA wykryto za pomocą sprzężonych z FITC drugorzędowych przeciwciał. Królicze anty-ludzkie perycentrina (Covance Inc., Richmond, Kalifornia, USA) wykryto biotynylowanym drugorzędowym przeciwciałem po obróbce w lodowatym metanolu. Testy angiogenezy. Proliferację komórek śródbłonka badano jak opisano (23) z 7,5 x 103 komórek na studzienkę. W przypadku proliferacji komórek nowotworowych komórki wysiewano w ilości 5 x 103 komórek na studzienkę
[podobne: zdrowe odżywianie dzieci, kolbuszowa dolna, wirusowe zapalenie krtani ]
[patrz też: mleko z biedronki wycofane, suplementy na wypadanie włosów, zst kolbuszowa ]