PPAR ligandy hamują wzrost guza pierwotnego i przerzuty przez hamowanie angiogenezy czesc 4

Co ciekawe, PPAR. Białko było wysoce eksprymowane w izolowanych komórkach śródbłonka nowotworowego (Figura 1c). Ponadto obserwowaliśmy wyższe poziomy ekspresji PPAR. w komórkach śródbłonka niż w komórkach nowotworowych, gdy oba typy komórek zostały wyizolowane z nowotworów LLC wyrażających GFP (Figura 1d). Ponadto porównaliśmy PPAR. ekspresja w proliferującym śródbłonku (guzie) i śródbłonku spoczynkowym (skóra) (Figura 1d). Czy ekspresja PPAR była o 71% wyższa. w śródbłonku nowotworowym (ryc. 1e). Aby określić, czy warunki wzrostu komórek śródbłonka wpływają na PPAR. ekspresję, przeprowadziliśmy immunoblotting na lizatach całych komórek HUVEC w warunkach proliferacji, zahamowania kontaktu lub głodzenia. Komórki hodowano w obecności 2,5% FBS, bFGF, VEGF, EGF i IGF-1 w warunkach stymulacji wzrostu iw 0,5% FBS i bez czynników wzrostu w warunkach głodzenia. W obu przypadkach komórki wykazywały 60% konfluencji. Ustaliliśmy, że PPAR. poziomy białka były wyższe w komórkach hodowanych w warunkach stymulujących wzrost w porównaniu z tymi w 6-dniowych 100% konfluentnych hodowlach (śródbłonek zahamowany przez kontakt) lub w podłożu głodowym (Figura 1f). Te dane pokazują, że PPAR. ekspresja jest wyższa w proliferacji śródbłonka niż w spokojnym śródbłonku. TZD indukują PPAR. aktywacja w komórkach śródbłonka in vitro Aktywacja PPAR. przez jego ligandy powoduje degradację proteolityczną samego receptora (27). Aby pokazać PPAR. aktywację w komórkach śródbłonka, przeprowadziliśmy badanie kinetyczne PPAR. poziomy w komórkach śródbłonka po leczeniu TZD. Po 17 godzinach leczenia rozyglitazonem, PPAR. poziomy białka zmniejszyły stymulowane przez czynnik wzrostu. komórki w pożywkach wzrostowych w sposób zależny od dawki, wskazując PPAR. aktywacja (rysunek 2a). Troglitazon podobnie obniżył PPAR. poziom w sposób zależny od dawki, podczas gdy PPAR. ligand (WY 14643) nie miał wpływu. Te dane pokazują, że PPAR. regulacja w dół wynika konkretnie z PPAR. aktywacja (rysunek 2b). Rycina 2 TZD aktywują śródbłonkowy PPAR. w sposób odwracalny względem laktacystyny. (a) Analiza Western blot PPAR. białko w proliferujących komórkach HUVEC. PPAR. obniżenie poziomu białka w sposób zależny od dawki z rozyglitazonem (Rosi). Kontrola, C3H / 10T 1/2 (w pełni zróżnicowane komórki C3H), kontrola pozytywna dla PPARy; ., HUVEC hodowane w mediach głodowych; +, HUVEC hodowano w podłożu stymulacyjnym (wzrostowym). (b) PPAR. białko spada z 5 .M (5T) i 10 .M (10T) troglitazonu. W przeciwieństwie do PPAR. aktywator WY 14643 przy 5. M (5W) nie działa. Stężenie rozyglitazonu 1R, 1. M. (c) PPAR. aktywacja może zostać odwrócona przez jednoczesne podanie 2,5. M laktacystyny. HUVEC traktowane zarówno rozyglitazonem, jak i laktacystyną (ścieżki 3 i 5) wykazują PPARa. ekspresja porównywalna z HUVEC potraktowanymi samym medium stymulacyjnym (linia 1). Sama laktacystyna nie ma wpływu na podstawowy PPAR. poziomy (linia 6). Wykazano, że szlak ubikwityna-proteosom reguluje stabilność PPAR-a. białko w adipocytach (27). Dlatego zapytaliśmy, czy PPAR. jest regulowany w komórkach śródbłonka w podobny sposób. W obecności 2,5 .M laktacystyny, inhibitora proteosomu, rozyglitazon nie wyzwalał PPARa. degradacja (Figura 2c). Fakt, że laktacystyna może całkowicie odwrócić działanie rozyglitazonu sugeruje, że rozyglitazon może indukować PPAR. degradacja przez proteosomy w komórkach śródbłonka. TZD mają bezpośrednie i pośrednie działanie antyangiogenne in vitro Bezpośrednie efekty. Aby pokazać działanie śródbłonkowego PPAR. Aktywacja na proliferację komórek, wykorzystaliśmy komórki BCE i indukowaliśmy ich proliferację za pomocą bFGF, silnego mitogenu dla komórek BCE, w standardowym teście proliferacji, jak podano (23, 28, 29). Rozyglitazon hamował indukowaną przez bFGF proliferację komórek BCE w sposób zależny od dawki, z maksymalnym hamowaniem około 94% po 72-godzinnym okresie inkubacji przy .M (Figura 3a) i około 69-74% po 7 dniach leczenia 0,01 – 0,1