Składnik Lewisa X w ludzkim mleku wiąże DC-SIGN i hamuje transfer HIV-1 do limfocytów T CD4 + ad 8

Frakcję lekką, głównie z monocytami, zebrano, przemyto i zaszczepiono w 24-studzienkowych lub 6-studzienkowych płytkach do hodowli o gęstości odpowiednio 5 x 105 komórek lub 2,5 x 106 na studzienkę. Po 60 minutach w 37 ° C, komórki adherentne hodowano w celu otrzymania iDCs w zmodyfikowanej przez Iscove. S pożywce Dulbecco (IMDM) z gentamycyną (86. G / ml) i 10% surowicą klonu płodowego (HyClone) uzupełnioną GM- CSF (500 U / ml) i IL-4 (250 U / ml). Pożywkę hodowlaną odświeżono w dniu 3, przy czym dojrzewanie komórek indukowano w dniu 6 przez hodowlę z poli (I: C) (20 .g / ml, Sigma-Aldrich). Po 2 dniach otrzymano dojrzałe CD14aCDlb + CD83 + DC, przemyto i użyto. Warunki hodowlane dla komórek LuSIV ze zintegrowanym długim reporterem replik o strukturze lucyferazy opisano wcześniej (66). Wirusy. Odpowiednie do replikacji zapasy wirusa HIV-1 zostały wygenerowane w wyniku przechodzenia wirusów przez limfocyty CD4 +, z zakaźną dawką hodowli tkankowej (TCID50 / ml) określoną poprzez ograniczenie rozcieńczenia na limfocytach wzbogaconych w CD4 + (67). W doświadczeniach wykorzystano wirusy klonowane podtypem B JR-CSF (R5), LAI (X4) i SF-162 (R5) oraz podtypu B pierwotnego NSI-18 (R5) i SI-19 (X4). Frakcje ludzkiego mleka i handlowe produkty mleczne. Zatwierdzenie wewnętrznej komisji rewizyjnej nie było wymagane, ponieważ próbki pobrano z odrzuconego materiału z jednego punktu czasowego. Próbki ludzkiego mleka odwirowywano kolejno przy 400 g i 530 g przez 10 minut, usuwając pipetą warstwy lipidowe. Próbki sterylizowano przez filtrację przez filtry strzykawkowe 0,45 .m i 0,2 .m (Schleicher & Schuell BioScience Inc.) i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Laktoferryna ludzka (Sigma-Aldrich), laktoferryna bydlęca (Sigma-Aldrich), ludzka (3-laktoalbumina (Sigma-Aldrich), bydlęca a-kazeina (NIZO Food Research), ludzki lizozym (Sigma-Aldrich), LNFP III (Calbiochem), SLPI (Sigma-Aldrich), trisacharyd LeX (Calbiochem), LeX-BSA, przekładka 14-atomowa (Calbiochem), PAA-LeX (syntetyczny), antyludzka LeX (mysz) IgM (Calbiochem) i antyludzka ARA- Zastosowano LAM (mysie) IgM. Wszystkie związki użyto w fizjologicznie istotnych stężeniach przez rozcieńczenie w PBS zawierającym 10% FCS. Bezpośrednie oznaczenie zakażenia HIV-1. Wzbogacone limfocyty CD4 + wysiano na 96-studzienkowych płytkach przy x 105 komórek / studzienkę w pożywce hodowlanej zawierającej IL-2 (3. Komórki inkubowano przez 2 godziny z ludzkim mlekiem rozcieńczonym w PBS zawierającym 10% FCS i dodawano 3,7 log TCID50 / ml HIV-1. Po 2 godzinach komórki przemyto i dodano świeżą pożywkę. Alternatywnie, po 2-godzinnej inkubacji ludzkiego mleka z HIV-1, wzbogacone mleko rozcieńczono PBS zawierającym 10% FCS przed dodaniem do limfocytów T CD4 +. W dniu 7 hodowli poziomy kapsydu wirusa (CA-p24) określono za pomocą testu ELISA. Test transferu HIV-1 za pośrednictwem DC-SIGN .. Komórki Raji i Raji-DC-SIGN wysiano w ilości 2 x 104 komórek / dołek w formacie 96-studzienkowym. Rozcieńczenia ludzkiego mleka lub ludzkiego mleka zostały wykonane w PBS zawierającym 10% FCS i wzbogacone o 3,7 log TCID50 / ml odpowiedniego wirusa przed dodaniem do komórek Raji-DC-SIGN. Jako kontrolę, do PBS zawierającego 10% FCS dodano ten sam TCID50 / ml odpowiedniego wirusa przed dodaniem do komórek Raji lub Raji-DC-SIGN. Po inkubacji hodowlę przemyto PBS przed dodaniem limfocytów T wzbogaconych w CD4 + w stężeniu x 105 komórek / studzienkę, przy czym CA-p24 oznaczono w dniu 7. Afektywne wiązanie DC-SIGNa Ab po ekspozycji na ludzkie mleko. Ludzkie mleko inkubowano z 50 x 103 Raji-DC-SIGN lub iDCs przez 15 minut w 37 ° C, po czym komórki przemywano TSM (20 mM Tris, 150 mM NaCl, mM CaCl2, 2 mM MgCl2) i komórki inkubowano w temperaturze 4 ° C przez 45 minut z 5 .g / ml specyficznego przeciwciała DC-SIGN Ab, AZN-D1 (6), AZN-D2 (12) lub anty-styk 4. Następnie komórki płukano i inkubowano z kozim anty-mysim FITC przez 45 minut w temperaturze 4 ° C. Komórki przemyto i ponownie zawieszono w 100 .l TSM zawierającego 0,5% BSA (frakcja V, beztłuszczowy bez kwasów, Calbiochem), a adhezję zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej (BD Biosciences). Test wiązania DC-SIGN. W celu preinkubacji HIV-1 z ludzkim mlekiem, rozcieńczenie 1: 4 ludzkiego mleka lub PBS zawierającego 10% FCS inkubowano z wysokim mianem wirusa (5,6 log TCID50 / ml) SF-162 przez godzinę w 37 ° C przed rozcieńczenie mieszaniny do 1: 667 przez dodanie 0,27 x 106 komórek Raji-DC-SIGN w formacie 24-studzienkowym. Komórki inkubowano przez 2 godziny w 37 ° C przed płukaniem PBS i dodaniem limfocytów T CD4 + w stężeniu x 106 komórek / ml, a następnie mierzono wytwarzanie CA-p24 w dniu 15 [hasła pokrewne: wirusowe zapalenie krtani, kolbuszowa dolna, przychodnia ożarów mazowiecki ] [przypisy: krem pod oczy z peptydami, sok z buraka właściwości, redukcja tkanki tłuszczowej dieta ]