Składnik Lewisa X w ludzkim mleku wiąże DC-SIGN i hamuje transfer HIV-1 do limfocytów T CD4 + ad 9

W celu preinkubacji komórek Raji-DC-SIGN z ludzkim mlekiem, rozcieńczenie ludzkiego mleka (1: 4) lub PBS zawierającego 10% FCS inkubowano z 0,27 x 106 komórek Raji-DC-SIGN w formacie 24-studzienkowym przez godzinę. godzinę w 37 ° C przed płukaniem PBS i dodaniem SF-162 (2,8 log TCID50 / ml). Komórki inkubowano przez 2 godziny przed płukaniem i dodaniem x 106 komórek / studzienkę limfocytów wzbogaconych w CD4 +, przy czym produkcja CA-p24 była mierzona w teście adhezji kulek w dniu 15. gp120. Kulki przygotowano jak opisano poprzednio (6). W skrócie, streptawidyna była kowalencyjnie sprzężona z modyfikowanymi karboksylanami TransFluoSpheres (wzbudzenie / emisja 488/645 nm, 1,0 um, Invitrogen Corp.). Kulki ze streptawidyną inkubowano z biotynylowanym fragmentem F (ab) 2 kozim-przeciwludzkim IgG (6 .g / ml, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.), a następnie inkubowano przez noc z chimerą gp120-Fc. Pięćdziesiąt tysięcy komórek Raji-DC-SIGN, iDCs lub komórek Raji-L-SIGN inkubowano wstępnie z mlekiem ludzkim lub mlekiem, AZN-D1 (6), AZN-D2 (12), EGTA lub mannanem przez 30 minut w pokoju temperatura. Powleczone ligandem kulki (20 kulek / komórkę) dodano do wstępnie inkubowanych komórek i inkubowano przez 30 minut w 37 ° C, po czym komórki przemyto TSM zawierającym 0,5% BSA. Po przemyciu komórki ponownie zawieszono w 100 .l buforu TSM-BSA, a adhezję zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej (BD Biosciences). Test ELISA wiązania DC-SIGN-Fc. W teście tym wykorzystano chimerę DC-SIGN-Fc, która zawierała zewnątrzkomórkową część DC-SIGN (aminokwasy 64-404) poddane fuzji na C-końcu z ludzkim fragmentem Fc IgG1, jak opisano wcześniej (56). Ludzkie mleko lub ludzkie mleko rozpuszczono w 0,2 M NaHCO3, opłaszczono na płytkach ELISA (płytka Maxisorp, Nunc) i inkubowano przez noc w 4 ° C lub 2 godziny w 37 ° C. Następnie blokowano TSM zawierającym 1% BSA przez 30 minut w 37 ° C przed dodaniem rozpuszczalnego DC-SIGN-Fc (5 ug / ml) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; wiązanie określono przez inkubację znakowanego peroksydazą przeciwciała anty-IgGl przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Specyficzność wiązania DC-SIGN-Fc określono przez wstępną inkubację DC-SIGN-Fc z 50. G / ml specyficznej dla DC-SIGN. Myszy Ab AZN-D1 (6) lub 10 mM EGTA. Badanie transmisji z jednym cyklem replikacji. Test przeprowadzono jak opisano wcześniej (58). W skrócie, mDC i iDC inkubowano na 96-studzienkowej płytce (35 x 103 do 50 x 103 DC / studzienkę) z ludzkim mlekiem przez 30 minut w 37 ° C przed dodaniem wirusa (5 ng CA-p24 / dołek), który inkubowano przez 2 godziny w 37 ° C. DC były płukane dwukrotnie PBS przed dodaniem 50 x 103 komórek LuSIV. Po 24 godzinach komórki LuSIV zebrano i ponownie zawieszono w 50 ul buforu do lizy (25 mM Tris-Cl 7,8, 2 mM DTT, 2 mM CDTA, 10% glicerolu, 1% Triton X-100). Komórki następnie inkubowano przez 45 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem, a następnie odwirowano przez 10 minut przy 3200 g. Supernatant przeniesiono na białą stałą 96-studzienkową płytkę (Costar; Corning) i dodano 150 ul buforu (100 ug / ml BSA, 6,6 mM ATP, 15 mM MgS04, 25 mM glicyloglicyny). Sto mikrolitrów DE (-) Lucyferyny (Roche Diagnostics GmbH) wstrzyknięto na studzienkę (0,28 mg / ml lucybuffera z wyłączeniem ATP). Komórki LuSIV (50 x 103) hodowane bez DC lub HIV-1 zastosowano do uzyskania wartości tła lucyferazy. Test przechwytywania. Aby zmierzyć wychwyt wirusa HIV-1 przez iDC, komórki inkubowano na 96-studzienkowej płytce (50 x 103 DC / studzienkę) z ludzkim mlekiem przez 30 minut w 37 ° C przed dodaniem wirusa (5 ng CA-p24 / studzienkę), którą inkubowano przez 2 godziny w 37 ° C. IDCs przemyto dwukrotnie PBS przed oznaczeniem stężenia CA-p24 standardowym testem ELISA. Statystyka. Wszystkie porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu ANOVA. P <0,01 i P <0,05 uznano za statystycznie istotne. PodziękowaniaTa praca została sfinansowana z dotacji z Fundacji Pomocy Dzieciom im. Elizabeth Glaser (27-PG-51269), Królewskiej Holenderskiej Akademii Sztuki i Nauk (do WA Paxton) oraz holenderskiego AIDSfonds (7008). Jesteśmy wdzięczni matkom za dostarczenie próbek mleka i dziękujemy Michelowi de Baar za krytyczną recenzję manuskryptu, Stefowi Heynenowi za jego fachową pomoc techniczną i Wimowi van Estowi za dzieło. Przypisy Stosowano nietypowe skróty: DC-SIGN, niespecyficzna absorbująca ICAM3-DC; iDC, niedojrzały DC; LeX, Lewis X; mDC, dojrzały DC; L-SIGN, specyficzna dla ICAM3 nieintegryna sprzęgająca z wątrobą i węzłem chłonnym; MTCT, przenoszenie z matki na dziecko; PAA, poliakryloamid; R5, koreceptor CCR5 wykorzystujący izolat HIV-1; SLPI, wydzielniczy inhibitor proteazy leukocytów; TCID, dawka zakaźna do hodowli tkankowej; X4, korektor CXCR4 wykorzystujący izolat HIV-1. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. [przypisy: zdrowe odżywianie dzieci, polskie towarzystwo ultrasonograficzne, zst kolbuszowa ] [podobne: szkoła rodzenia madalińskiego, mleko z biedronki wycofane, suplementy na wypadanie włosów ]