Wiązanie cholesterolu, wypływ i domena oddziałująca z PDZ receptora zmiatającego BI pośredniczy w sygnalizacji inicjowanej przez HDL ad 5

Ta chimera wykazywała wiązanie fotocholesterolu porównywalne do wiązania dzikiego typu SR-BI. Oceniano także zdolności SR-BII i SR-BI. 509 do wiązania fotocholesterolu. Zgodnie z oczekiwaniami w oparciu o wyniki przedstawione na Figurze 7B, oba fotocholesterol związany z SR-BII i SR-BI-A-509 (dane nie pokazane). Dodatkowo badano swoistość wiązania cholesterolu błonowego w osoczu z SR-BI w badaniach porównujących SR-BI, CD / SRCT i trzeciego członka rodziny receptorów zmiatających B, LIMP-II. LIMP-II jest rezydującym lizosomalnym białkiem błonowym. Stosując C-koniec SR-BI, który pośredniczy w celowaniu w błonę komórkową, lub lizosomalną sekwencję kierującą LIMP-II, skierowaliśmy wszystkie receptory zmiatające klasy B do błony komórkowej lub błony lizosomalnej i oceniano wiązanie cholesterolu (Figura 8). Jak pokazano na Fig. 7B, immunoprecypitacja SR-BI z błony komórkowej wykazywała wyższy poziom wiązania fotocholesterolu niż CD / SRCT. LIMP-II skierowany na błonę plazmatyczną przez C-koniec SR-BI (LIMP-II / SRCT) wykazywał minimalne wiązanie fotocholesterolu. Równolegle do ustaleń dotyczących SR-BI na błonie plazmatycznej, SR-BI skierowany do błony lizosomalnej (SR-BI / LIICT) przy użyciu motywu kierującego kierowaniem do Lile2-Dileucine (31) wiązał fotocholesterol w większym stopniu niż CD36 kierowany lizosomem ( CD36 / LIICT) lub LIMP-II w jego natywnej subkomórkowej lokalizacji na błonach lizosomalnych. Dlatego też członkowie rodziny receptorów klasy 3 B, SR-BI są wyjątkowo zdolni do wiązania cholesterolu. Figura 8SR-BI wiąże albo błonę plazmatyczną, albo lizosomalny cholesterol błonowy. Komórki HEK 293 transfekowano SR-BI, CD / SRCT, LIMP-II / SRCT, SR-BI / LIICT, CD36 / LIICT lub LIMP-II i znakowano [3H] fotocholesterolem; nałożono błony plazmatyczne lub błony lizosomalne; receptory immunoprecypitowano przeciwciałem do C-końcowego ogonka SR-BI lub do LIMP-II; a fotocholesterol [3H] związany z receptorem oceniano za pomocą autoradiografii (u góry). Objętość immunoprecypitowanego receptora oceniano metodą Western blotting (na dole) i obliczono względną ilość receptora związanego [3H] z fotocholesterolem w stosunku do receptora całkowitego. W celu dalszego zbadania wymagań C-końcowej domeny transbłonowej SR-BI w transdukcji sygnału, zbadaliśmy 2 dodatkowe chimery (Figura 6). Chimery składające się głównie z SR-BI z zewnątrzkomórkową domeną CD36 (SR / CDECL / SR) i SR-BI z C-końcową domeną transbłonową CD36 (SR / CDTM / SR) badano pod względem fosforylacji eNOS i aktywacji enzymu (Figura 9A). SR / CDECL / SR wiąże HDL z powinowactwem podobnym do powinowactwa typu dzikiego typu SR-BI, ale indukuje wypływ cholesterolu na poziomie 25% poziomu dzikiego typu SR-BI i podobnie do CD36 typu dzikiego (32). SR-BI typu dzikiego powodował fosforylację i aktywację eNOS w odpowiedzi na HDL, C-końcowo znakowany CD36 nie, a SR / CDECL / SR powodował oba zdarzenia sygnalizacyjne. Przeciwnie, SR / CDTM / SR, który pośredniczy w wypływie cholesterolu porównywalnie do SR-BI (dane nie pokazane), nie fosforyluje ani nie aktywuje eNOS. SR / CDECL / SR wykazywały znaczącą zdolność do wiązania cholesterolu, podczas gdy SR / CDTM / SR nie, co równolegle z wynikami dla aktywacji eNOS (Figura 9, B i C). Figura 9CD36 zewnątrzkomórkowa domena jest zdolna do transdukcji sygnału, jeśli obecne są transbłonowe i cytoplazmatyczne domeny SR-BI. (A) Komórki COS-M6 transfekowano cDNA eNOS i cDNA SR / BI typu dzikiego, CD / SRCT, SR / CDECL / SR lub SR / CDTM / SR. W celu wykrycia fosforylacji eNOS (po lewej), 24 godziny po transfekcji komórki głodzono w DMEM bez surowicy przez kolejne 24 godziny, komórki inkubowano z HDL (50 .g / ml) przez 0 lub 10 minut, i lizaty komórkowe były analizowano techniką Western blot stosując przeciwciało monoklonalne anty-fosfo-eNOS (specyficzne dla Ser1179) i przeciwciało monoklonalne anty-eNOS. Do wykrywania aktywacji eNOS (po prawej) zastosowano równoległe zestawy transfekowanych komórek i zmierzono konwersję [3H] L-argininy do [3H] L-cytruliny podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym lub HDL (50 ug / ml ). Wartości (średnia . SEM) wyrażono jako procent aktywności stymulowanej HDL powyżej podstawowej aktywności; n = 4. * P <0,05 versus SR-BI typu dzikiego. (B i C) komórki HEK 293 transfekowano konstruktami pokazanymi w A i znakowano [3H] fotocholesterolem; receptory immunoprecypitowano przeciwciałem do C-końcowego ogonka SR-BI; a fotocholesterol [3H] związany z receptorem oceniano za pomocą autoradiografii (u góry). Objętość immunoprecypitowanego receptora oceniano metodą Western blotting (na dole) i obliczono względną ilość receptora związanego [3H] z fotocholesterolem w stosunku do receptora całkowitego. Dyskusja Podstawy ochrony przed miażdżycą zapewniane przez HDL i SR-BI są słabo poznane [więcej w: szkoła rodzenia madalińskiego, redukcja tkanki tłuszczowej dieta, syrop tymiankowy złożony ] [podobne: szkoła rodzenia madalińskiego, mleko z biedronki wycofane, suplementy na wypadanie włosów ]