Wiązanie cholesterolu, wypływ i domena oddziałująca z PDZ receptora zmiatającego BI pośredniczy w sygnalizacji inicjowanej przez HDL ad 8

BAEC przygotowano i namnożono zgodnie ze standardowymi procedurami w pożywce EGM-2 (Biowhittaker Inc.). Eksperymenty przeprowadzono w pasażu 5. 8. Komórki COS-M6, które eksprymują nieznaczną ilość endogennego SR-BI i są pozbawione eNOS, utrzymywano w DMEM (Sigma-Aldrich) z 10% płodową surowicą cielęcą (Invitrogen Corp.). Komórki HEK 293 utrzymywano zgodnie z wcześniejszym opisem (48). Komórki COS-M6 lub komórki HEK 293 transfekowano różnymi cDNA przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.) zgodnie z instrukcjami producenta. Transfekowane komórki badano 48 godzin po transfekcji i zazwyczaj osiągnięto wydajność transfekcji 70-80%. cDNA dla eNOS typu dzikiego, SR-BI, SR-BII, SR-BI. 509, mutanta AVI i chimer mysich SR-BI i CD36 przygotowano jak opisano wcześniej (9, 14, 22. 24, 32) ( Figura 6). Oznaczenia aminokwasów w chimerach były następujące: aminokwasy CD / SRCT, CD36 aminokwasy 458 i SR-BI 464 ~ 509; CD / SRCTMT, aminokwasy CD36 aminokwasy 435 i SR-BI 436. 509; SR / CDECL / SR, aminokwasy CD36 44 a 435 i aminokwasy SR-BI 1, 41 i 436. 509; SR / CDTM / SR, aminokwasy SR-BI 435, a następnie aminokwasy CD36 436. 471 i aminokwasy SR-BI 464. 509. W zmutowanym AVI SR-BI, epitopy adenowirusa / M45 (14 aminokwasów) wstawiono do miejsca w sekwencji kodującej zewnątrzkomórkową domenę SR-BI C-końcową do aminokwasu 424. cDNA dla SR-BII był uprzejmy dostarczone przez Nancy R. Webb (University of Kentucky, Lexington, Kentucky, USA). Należy zauważyć, że CD / SRCT dostarcza pełnej długości CD36, który jest znakowany C-końcowo przez dodanie sekwencji kodującej dla ostatnich 45 aminokwasów SR-BI. Z tego powodu, równą ekspresję różnych konstruktów można potwierdzić za pomocą analizy immunoblot przy użyciu przeciwciała przeciwko wspólnej C-końcowej domenie SR-BI (Novus Biologicals Inc.), i immunoprecypitacja była wykonalna dla tego samego przeciwciała. Wszystkie funkcje testowane na natywny CD36 zostały podsumowane przez CD / SRCT. Przeprowadziliśmy dodatkowe eksperymenty z użyciem cDNA dla lizosomalnego integralnego białka błonowego LIMP-II, które jest wysoce homologiczne do CD36 (49) i chimery LIMP-II i SR-BI oraz LIMP-II i CD36. C-końcowa lizosomalna sekwencja docelowa mysich LIMP-II (R456 do T478) została zastąpiona ostatnimi 45 aminokwasami SR-BI (LIMP-II / SRCT) w celu skierowania LIMP-II do błony plazmatycznej. Skonstruowaliśmy chimery SR-BI / LIMP-II i CD36 / LIMP-II zastępując lizosomalny sygnał kierujący LIMP-II (R459 do T478) dla ostatnich 45 aminokwasów SR-BI (SR-BI / LIICT) lub dla cały C-koniec mysiego CD36 (CD36 / LIICT), odpowiednio (31, 50). Wszystkie konstrukty wytworzono metodą PCR i potwierdzono analizą sekwencji. Bezpośrednie ukierunkowanie LIMP-II / SRCT na błony plazmatyczne i SR-BI / LIICT i CD36 / LIICT na błony lizosomalne potwierdzono za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Aktywacja eNOS. Aktywację eNOS w nienaruszonych pierwotnych komórkach śródbłonka lub transfekowanych komórkach COS-M6 oceniano przez pomiar konwersji [3H] L-argininy (45. 70 Ci / mmol, mCi / ml, PerkinElmer Life and Analytical Sciences) do [3H] L-cytruliny. podczas 15-minutowych inkubacji przy użyciu wcześniej opisanych metod (51). Środki stosowane do testowania aktywacji eNOS obejmowały ludzki HDL, 2% CD lub obciążone cholesterolem CD, PC-HDL, SUV i cząstki Lp2A-I składające się z rekombinowanych apoA-I i POPC w stosunkach molowych 80: lub 40: 1, z dodanym lub bez cholesterolu w stosunku molowym 5: do apoA-I. Te środki przygotowano w sposób opisany uprzednio (13, 16. 18). Godne uwagi jest, że Gong i jego współpracownicy donoszą, że HDL wyizolowana od żeńskich ludzi lub myszy ma większą zdolność do stymulowania eNOS niż HDL od mężczyzn lub myszy, co sugeruje rolę estradiolu związanego z HDL (35). Jednak odpowiedzi zależne od HDL były widoczne przy stężeniach lipoprotein, które dostarczałyby estradiol na poziomie tak niskim jak 5 x 10. 16 M (35), który jest 6 rzędów wielkości niższy niż stężenie pokazane w celu aktywacji eNOS we wcześniejszych raportach (52, 53), a Nofer i jego współpracownicy nie znaleźli ostatnio żadnej różnicy w odpowiedzi na HDL pochodzącą od mężczyzn i kobiet (36). Ponadto wykazaliśmy aktywację eNOS HDL w systemie komórkowym pozbawionym receptorów estrogenu (14). Na podstawie tych wyników w obecnych eksperymentach nie zostały rozróżnione odpowiedzi na HDL pochodzące od mężczyzn i kobiet. Wszystkie wyniki zostały potwierdzone w co najmniej 3 niezależnych badaniach. Analizy immunoblotowe. Analizy immunoblot przeprowadzono przy użyciu odczynników ECL (Amersham Biosciences) do chemiluminescencji. W celu oceny fosforylacji eNOS w Ser1179 w odpowiedzi na HDL, komórki eksponowano na HDL (50 ug / ml) przez 0. 10 minut, otrzymano lizaty całokomórkowe i przeprowadzono analizę immunoblot z poliklonalnym przeciwciałem anty-fosfo-eNOS. (Cell Signaling Technology) i przeciwciało monoklonalne anty-eNOS (BD Biosciences. Pharmingen)
[patrz też: kolbuszowa dolna, wydłużenie etapu edukacyjnego uzasadnienie, instytucje zajmujące się pomocą dla młodzieży z problemami rodzinnymi ]
[patrz też: niepokój manipulacyjny, wirusowe zapalenie krtani, zdrowe odżywianie dzieci ]