Oceniliśmy poziomy ekspresji różnych chimer SR-BI i CD36 i mutantów SR-BI w lizatach całych komórek, stosując przeciwciała poliklonalne SR-BI rozpoznające C-końcowe lub zewnątrzkomórkowe domeny receptora (Novus Biologicals Inc.). Ekspresję na powierzchni komórek oceniano przez biotynylację, immunoprecypitację z przeciwciałem przeciwko C-końcu SR-BI i sondowanie koniugatem streptawidyna-HRP. Ekspresję konstruktów pokrewnych LIMP-IIp oceniano po immunoprecypitacji za pomocą analizy immunoblot z poliklonalnym przeciwciałem anty-LIMP-II wytwarzanym u królika przeciwko peptydowi odpowiadającemu ostatniemu 15 aminokwasom mysiego LIMP-II. Wypływ cholesterolu. Upływ cholesterolu mierzono metodami poprzednio opisanymi gdzie indziej (16). Pokrótce, komórki HEK 293 transfekowano dzikiego typu SR-BI lub CD36 lub chimerami lub mutantami, komórki znakowano przez 24 godziny 5. Ci / ml [3H] cholesterolu (PerkinElmer Life and Analytical Sciences) w DMEM zawierającym 10% cielęcia surowicy, a wypływ cholesterolu [3H] mierzono w trzech powtórzeniach podczas 2-godzinnych inkubacji z HDL (10 .g / ml). Uwalnianie radioaktywnego cholesterolu mierzono za pomocą zliczania scyntylacyjnego. Wiązanie fotocholesterolu. Aby ocenić zdolność konstruktów związanych z receptorem zmiatającym receptor B do wiązania komórkowego cholesterolu, transfekowane komórki HEK 293 lub komórki COS-M6 inkubowano przez 16 godzin w pożywce pozbawionej lipidów zawierającej [3H] 6-fotocholesterol skompleksowany z CD lub w 10% FBS, przemyte i nadfioletowe napromieniowane przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Komórki poddano lizie, przeprowadzono immunoprecypitację stosując przeciwciało przeciw C-końcowemu ogonowi SR-BI, a immunoprecypitaty analizowano za pomocą analizy SDS-PAGE / fluorography i immunoblot. Niedawno zastosowano porównywalne podejście, aby wykazać bezpośrednie wiązanie cholesterolu z SCAP (30). Ustalenia dotyczące wiązania fotocholesterolu były identyczne w komórkach HEK 293 i COS-M6. Podobne strategie zastosowano po izolacji błon plazmatycznych lub błon lizosomalnych w celu oceny wiązania cholesterolu z konstruktami pokrewnymi LIMP-II. Analiza statystyczna. Różnice między grupami oceniano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA po ustaleniu równoważności wariancji i prawidłowego rozkładu danych. Do porównań post hoc użyliśmy testu Studenta-Newmana-Keulsa. Podane wartości są średnie. SEM; n = 4. P <0,05 uznano za statystycznie istotny. Podziękowania Jesteśmy wdzięczni Marilyn Dixon za przygotowanie tego manuskryptu. Praca ta została wsparta przez NIH granty HL58888 i HL53546 (do PW Shaul), HL63768 (do DL Williams), i HL22633 i HL63768 (do M. de la Llera-Moya), przez dotacje z American Heart Association (AHA0130305N do DL Silver i 0235107N do C. Mineo) oraz przez Pfizer International HDL Research Award (CU51610503 do DL Silver). Projekt był również wspierany w części przez Crystal Ball Ball Center dla pediatric Critical Care Research i przez Lowe Foundation. Przypisy Chatchawin Assanasen i Chieko Mineo w równym stopniu przyczyniły się do tej pracy. Philip W. Shaul i David L. Silver są współautorami. David L. Williams nie żyje. Zastosowano nietypowe skróty: BAEC, komórka śródbłonka aorty; CD, metylo-P-cyklodekstryna; Lp2A-I, lipoproteina zawierająca 2 cząsteczki apolipoproteiny AI; NPC1, Niemann-Pick C1; PC, fosfatydylocholina; PC-HDL, HDL z obsługą komputera; POPC, palmitoilooleoilofosfatydylocholina; SCAP, białko aktywujące rozszczepienie SREBP .; S1P, sfingozyno-1-fosforan; SR-BI, receptor zmiatający BI; StAR, steroidogeniczne ostre białko regulatorowe; START, transfer lipidów zależny od StAR; SUV, mały pęcherzyk jednowarstwowy. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. [hasła pokrewne: badanie kału na pasożyty, suplementy na wypadanie włosów, redukcja tkanki tłuszczowej dieta ] [więcej w: syrop tymiankowy złożony, narodowy fundusz zdrowia w łodzi, przychodnia ożarów mazowiecki ]
Partnerzy serwisu:
Zobacz tez:
Rozwój i utrzymanie jajników są słabo poznane; jednak choroby, które wpływają na te procesy, mogą dostarczyć wgląd w podstawowe mechanizmy. XX żeńska dysgenezja gonad (XX-GD) jest rzadkim, genetycznie heterogennym zaburzeniem,… Read More Mutacja w genie nukleoporyny-107 powoduje dysgenezję XX gonad
Rekombinowaną szczurzą proreninę analizowano metodą immunoblottingu przy użyciu 3 nM oczyszczonego Ab do HRP pod nieobecność (a) ścieżki 1) lub obecności (3M regionalnych peptydów prosegmentu proreninowego, SFGR (linia 2), MTRISAE… Read More Hamowanie nefropatii cukrzycowej przez peptyd wabika odpowiadający uchwytowi region dla nieprololitycznej aktywacji proreniny ad
Szczep LF82 E. coli, wyizolowany z przewlekłej zmiany jelita krętego pacjenta CD, zastosowano jako szczep referencyjny dla AIEC, a także 4 innych szczepów AIEC, LF31, LF71, LF73 i LF100 (12).… Read More CEACAM6 działa jako receptor adherentno-inwazyjnych E. coli, wspomagając kolonię błony śluzowej jelita cienkiego w chorobie Leśniowskiego-Crohna ad 8