Wiązanie cholesterolu, wypływ i domena oddziałująca z PDZ receptora zmiatającego BI pośredniczy w sygnalizacji inicjowanej przez HDL ad 9

Oceniliśmy poziomy ekspresji różnych chimer SR-BI i CD36 i mutantów SR-BI w lizatach całych komórek, stosując przeciwciała poliklonalne SR-BI rozpoznające C-końcowe lub zewnątrzkomórkowe domeny receptora (Novus Biologicals Inc.). Ekspresję na powierzchni komórek oceniano przez biotynylację, immunoprecypitację z przeciwciałem przeciwko C-końcu SR-BI i sondowanie koniugatem streptawidyna-HRP. Ekspresję konstruktów pokrewnych LIMP-IIp oceniano po immunoprecypitacji za pomocą analizy immunoblot z poliklonalnym przeciwciałem anty-LIMP-II wytwarzanym u królika przeciwko peptydowi odpowiadającemu ostatniemu 15 aminokwasom mysiego LIMP-II. Wypływ cholesterolu. Upływ cholesterolu mierzono metodami poprzednio opisanymi gdzie indziej (16). Pokrótce, komórki HEK 293 transfekowano dzikiego typu SR-BI lub CD36 lub chimerami lub mutantami, komórki znakowano przez 24 godziny 5. Ci / ml [3H] cholesterolu (PerkinElmer Life and Analytical Sciences) w DMEM zawierającym 10% cielęcia surowicy, a wypływ cholesterolu [3H] mierzono w trzech powtórzeniach podczas 2-godzinnych inkubacji z HDL (10 .g / ml). Uwalnianie radioaktywnego cholesterolu mierzono za pomocą zliczania scyntylacyjnego. Wiązanie fotocholesterolu. Aby ocenić zdolność konstruktów związanych z receptorem zmiatającym receptor B do wiązania komórkowego cholesterolu, transfekowane komórki HEK 293 lub komórki COS-M6 inkubowano przez 16 godzin w pożywce pozbawionej lipidów zawierającej [3H] 6-fotocholesterol skompleksowany z CD lub w 10% FBS, przemyte i nadfioletowe napromieniowane przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Komórki poddano lizie, przeprowadzono immunoprecypitację stosując przeciwciało przeciw C-końcowemu ogonowi SR-BI, a immunoprecypitaty analizowano za pomocą analizy SDS-PAGE / fluorography i immunoblot. Niedawno zastosowano porównywalne podejście, aby wykazać bezpośrednie wiązanie cholesterolu z SCAP (30). Ustalenia dotyczące wiązania fotocholesterolu były identyczne w komórkach HEK 293 i COS-M6. Podobne strategie zastosowano po izolacji błon plazmatycznych lub błon lizosomalnych w celu oceny wiązania cholesterolu z konstruktami pokrewnymi LIMP-II. Analiza statystyczna. Różnice między grupami oceniano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA po ustaleniu równoważności wariancji i prawidłowego rozkładu danych. Do porównań post hoc użyliśmy testu Studenta-Newmana-Keulsa. Podane wartości są średnie. SEM; n = 4. P <0,05 uznano za statystycznie istotny. Podziękowania Jesteśmy wdzięczni Marilyn Dixon za przygotowanie tego manuskryptu. Praca ta została wsparta przez NIH granty HL58888 i HL53546 (do PW Shaul), HL63768 (do DL Williams), i HL22633 i HL63768 (do M. de la Llera-Moya), przez dotacje z American Heart Association (AHA0130305N do DL Silver i 0235107N do C. Mineo) oraz przez Pfizer International HDL Research Award (CU51610503 do DL Silver). Projekt był również wspierany w części przez Crystal Ball Ball Center dla pediatric Critical Care Research i przez Lowe Foundation. Przypisy Chatchawin Assanasen i Chieko Mineo w równym stopniu przyczyniły się do tej pracy. Philip W. Shaul i David L. Silver są współautorami. David L. Williams nie żyje. Zastosowano nietypowe skróty: BAEC, komórka śródbłonka aorty; CD, metylo-P-cyklodekstryna; Lp2A-I, lipoproteina zawierająca 2 cząsteczki apolipoproteiny AI; NPC1, Niemann-Pick C1; PC, fosfatydylocholina; PC-HDL, HDL z obsługą komputera; POPC, palmitoilooleoilofosfatydylocholina; SCAP, białko aktywujące rozszczepienie SREBP .; S1P, sfingozyno-1-fosforan; SR-BI, receptor zmiatający BI; StAR, steroidogeniczne ostre białko regulatorowe; START, transfer lipidów zależny od StAR; SUV, mały pęcherzyk jednowarstwowy. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. [hasła pokrewne: badanie kału na pasożyty, suplementy na wypadanie włosów, redukcja tkanki tłuszczowej dieta ] [więcej w: syrop tymiankowy złożony, narodowy fundusz zdrowia w łodzi, przychodnia ożarów mazowiecki ]