Wiązanie cholesterolu, wypływ i domena oddziałująca z PDZ receptora zmiatającego BI pośredniczy w sygnalizacji inicjowanej przez HDL ad

W ostatnich pracach wykazaliśmy, że w stymulacji HDL eNOS pośredniczy aktywacja kinazy rodziny Src, PI3K, kinazy Akt i MAPK oraz fosforylacja eNOS w Ser1179 (14). Tak więc, HDL indukuje wiele procesów sygnałowych, które mogą być kluczowe dla miażdżycowych właściwości lipoproteiny. Jednak najbardziej bliższe zdarzenia leżące u podstaw sygnalizacji inicjowanej przez HDL nie zostały jeszcze wyjaśnione. Celem niniejszego badania było określenie podstawy molekularnej zdarzenia sygnalizacyjnego indukowanego przez HDL poprzez SR-BI poprzez badanie mechanizmów proksymalnych w aktywacji eNOS HDL. Eksperymenty zostały zaprojektowane w celu określenia, czy sygnalizacja wymaga rozpoznanej funkcji HDL do powodowania przepływu cholesterolu do lub z komórek i do ograniczania strukturalnych cech SR-BI niezbędnych do transdukcji sygnału. Wyniki Strumień cholesterolu i sygnalizacja HDL. Aby zbadać rolę strumienia cholesterolu w stymulacji eNOS za pośrednictwem HDL, porównaliśmy wpływ CD-y metylo-y-cyklodekstryny (CD) i CD20 z natywnym HDL na komórki śródbłonka aorty bydlęcej (BAEC). Jak pokazano na Figurze 1A, 15-minutowa inkubacja z CD-free CD indukowała aktywację eNOS w takim samym stopniu jak inkubacja z HDL. Inkubacja z CD przez 15 minut nie wypierała eNOS z błony komórkowej (dane nie pokazane), co jest zdarzeniem, które występuje, jeśli komórki śródbłonka są traktowane CD przez dłuższy czas (15). W przeciwieństwie do CD bez cholesterolu, CD obciążone cholesterolem nie stymulowało aktywacji eNOS, co wskazuje, że wypływ cholesterolu jest ważny dla aktywacji eNOS. Następnie zbadaliśmy rolę wypływu cholesterolu w HDL w tym procesie stosując HDL (PC-HDL) obciążony PC (Figura 1B); dodanie PC do HDL zwiększa wypływ do lipoproteiny (16). PC-HDL o stężeniu 5 ug / ml był zdolny do stymulowania eNOS, podczas gdy natywny HDL nie był. Przy wyższym stężeniu (20 .g / ml), natywny HDL i PC-HDL dawały podobną stymulację. W dodatkowych doświadczeniach, wolne od cholesterolu cząsteczki Lp2A-I (lipoproteiny zawierające 2 cząsteczki apolipoproteiny AI) składające się z apoA-I i palmitoilooleoilofosfatydylocholiny (POPC) powodowały aktywację eNOS w BAECs porównywalną do tej indukowanej przez natywny HDL (Figura 2A); zmiany w zawartości POPC dały zmiany w sygnalizacji, które równolegle wykazywały uprzednio wykazane zmiany w objętości wypływu (Figura 2B) (17, 18); a dodanie cholesterolu do Lp2A-I zapobiegło sygnalizacji (figura 2C). Podsumowując, dane wskazują, że cząstki, które łatwo akceptują komórkowy cholesterol, aktywują eNOS, podczas gdy te, które służą jako dawcy cholesterolu, nie. Rysunek Wypływ cholesterolu jest wymagany do stymulacji HDL eNOS. (A) Aktywację eNOS oceniano w BAEC mierząc [3H] L-argininę do konwersji [3H] L-cytruliny podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym (Basal), HDL (50 .g / ml), CD (2% ), lub obciążonego cholesterolem CD (Chol-CD, 2%). (B) Aktywację eNOS w BAEC oceniano podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym, HDL (5 i 20 .g / ml) lub PC-HDL (5 i 20 .g / ml). Wartości (średnia . SEM) wyrażono względem podstawowej aktywności, oznaczonej jako 100%; n = 4. * P <0,05 versus basal; P <0,05 w porównaniu do braku cholesterolu. P <0,05 versus HDL. Figura 2 Nie zawierające cholesterolu, cząstki Lp2A-I aktywują eNOS. (A) Aktywację eNOS w BAEC oceniano przez pomiar konwersji [3H] L-argininy do [3H] L-cytruliny podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym, HDL (20 .g / ml) lub cząstkami Lp2A-I o stosunek molowy POPC / apoA-I wynosi 80: (20 .g / ml). (B) Aktywację eNOS w BAEC oceniano podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym, HDL (1, 5 i 20 .g / ml), cząstkami Lp2A-I o stosunku molowym POPC / apoA-I wynoszącym 40: ( 1, 5 i 20 .g / ml) lub cząstki Lp2A-I o stosunku molowym POPC / apoA-I wynoszącym 80: (1, 5 i 20 .g / ml). Białe słupki, ug / ml; szare słupki, 5 ug / ml; czarne słupki, 20 .g / ml. (C) Aktywację eNOS w BAEC oceniano podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym, HDL (20 .g / ml), cząstkami Lp2A-I z molowym stosunkiem POPC / cholesterol / apoA-I wynoszącym 80: 0: (20 yg / ml), lub cząstki Lp2A-I o stosunku molowym POPC / cholesterol / apoA-I wynoszącym 80: 5: (20 (ig / ml). Wartości (średnia . SEM) wyrażono względem podstawowej aktywności oznaczonej jako 100%; n = 4. * P <0,05 versus basal; P <0,05 w porównaniu do braku cholesterolu. Zmodyfikowaliśmy również SR-BI, aby ocenić rolę wypływu w sygnalizacji HDL. Wpływ przeciwciała neutralizującego SR-BI3, który wiąże się z zewnątrzkomórkową domeną SR-BI i zapobiega wypływowi cholesterolu z udziałem SR-BI (19), testowano w BAEC (Figura 3A). W komórkach preinkubowanych z neutralizującym przeciwciałem, HDL nie stymulowało eNOS, podczas gdy preinkubacja z kontrolą IgG nie miała wpływu [podobne: wirusowe zapalenie krtani, kalendarz triathlon 2015, zss kolbuszowa dolna ] [przypisy: narodowy fundusz zdrowia w łodzi, przychodnia ożarów mazowiecki, badanie kału na pasożyty ]