Wiązanie cholesterolu, wypływ i domena oddziałująca z PDZ receptora zmiatającego BI pośredniczy w sygnalizacji inicjowanej przez HDL cd

Przeciwnie, aktywacja CD eNOS była podobna pod nieobecność lub obecność neutralizującego przeciwciała (stymulacja do 204%. 34% i 188%. 20% podstawowej aktywności, odpowiednio), co jest zgodne z funkcją CD niezależną od wiązania z SR -BI (20, 21). Aby jeszcze bardziej ustalić rolę dla wypływu cholesterolu, przeprowadzono doświadczenia z natywnym HDL i małymi jednowarstwowymi pęcherzykami (SUV) w komórkach COS-M6 eksprymujących eNOS i albo SR-BI typu dzikiego albo mutant AVI z SR-BI (Figura 3B). Podczas gdy receptor typu dzikiego pośredniczy w wydzielaniu do HDL lub SUV, mutant AVI jest zdolny do wypływu HDL, ale nie do SUV (22). Aktywacja eNOS przez HDL i SUV równolegle do ich indukcji wypływu cholesterolu: eNOS aktywowany HDL przez dziki SR-BI lub mutant AVI, a SUV powodowały stymulację eNOS wyłącznie w komórkach eksprymujących receptor typu dzikiego. Figura 3Interwencje, które zmniejszają zdolność wypływu SR-BI, osłabiają stymulację eNOS. (A) BAEC preinkubowano kontrolnym przeciwciałem blokującym IgG lub SR-BI przez 30 minut, a aktywację eNOS oceniano podczas 15 minut inkubacji z buforem kontrolnym lub HDL (50 .g / ml). (B) Komórki COS-M6 transfekowano cDNA eNOS i albo cDNA SR-BI typu dzikiego typu SR-BI lub zmutowanym AVI. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji aktywację eNOS oceniano podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym, HDL (20 i 50 .g / ml) lub SUV (250 lub 500 .g / ml). Wartości (średnia . SEM) wyrażono względem podstawowej aktywności oznaczonej jako 100%; n = 4. * P <0,05 vs podstawowe; P <0,05 względem braku SR-BI Ab; P <0,05 versus SR-BI typu dzikiego. Sygnalizacja SR-BI i HDL. Aby dodatkowo określić specyficzną rolę SR-BI, porównaliśmy zdolność CD36 i SR-BI do przekazywania sygnalizacji HDL w komórkach COS-M6 eksprymujących eNOS. HDL wiąże się z takim samym powinowactwem zarówno do SR-BI jak i CD36, ale CD36 indukuje około 75% mniej wypływu cholesterolu w porównaniu z SR-BI (7, 9). Podczas gdy SR-BI dawał aktywację eNOS po związaniu HDL, CD36 nie (Figura 4A). Figura 4SR-BI jest wymagana do aktywacji eNOS z udziałem HDL. (A) Komórki COS-M6 transfekowano cDNA eNOS i cDNA SR-BI lub CD36. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji, aktywację eNOS oceniano przez pomiar [3H] L-argininy do konwersji [3H] L-cytruliny podczas 15 minut inkubacji z buforem kontrolnym lub HDL (50 .g / ml). * P <0,05 versus basal; P <0,05 względem SR-BI. (B) Komórki COS-M6 transfekowano cDNA eNOS i albo pozorowano plazmid lub cDNA SR-BI. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji aktywację eNOS oceniano podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym, HDL (50 .g / ml) lub CD (2%). * P <0,05 versus basal; P <0,05 versus fikcja. Wartości (średnia . SEM) wyrażono względem podstawowej aktywności oznaczonej jako 100%; n = 4. Aby sprawdzić, czy SR-BI jest wymagany do aktywacji eNOS w odpowiedzi na wypływ cholesterolu, niezależnie od jego zdolności do wiązania HDL, ocenialiśmy aktywację eNOS przez CD w komórkach COS-M6 pozbawionych lub eksprymujących SR-BI. Jak pokazano na Fig. 4B, zależna od HDL i związana z CD aktywacja eNOS była zależna od SR-BI. C-końcowa domena cytoplazmatyczna SR-BI i sygnalizacja HDL. W poprzedniej pracy opisującej, w jaki sposób SR-BI przekazuje sygnał przez HDL do aktywacji eNOS, dodanie przeciwciała przeciw C-końcowej domenie cytoplazmatycznej receptora hamowało aktywację eNOS przez HDL w izolowanych błonach plazmatycznych (13). Aby dalej badać rolę C-końcowej domeny cytoplazmatycznej, testowaliśmy zdolność SR-BII do pośredniczenia w fosforylacji eNOS i aktywacji enzymu w komórkach COS-M6 eksprymujących eNOS (Figura 5). SR-BII jest wariantem splicingowym SR-BI, który ma identyczną budowę, z wyjątkiem C-końcowej domeny cytoplazmatycznej, a SR-BII wykazuje wiązanie HDL i strumień cholesterolu podobny do SR-BI (23). W przeciwieństwie do SR-BI, SR-BII nie stymulowało fosforylacji eNOS (Figura 5, góra) ani aktywności enzymatycznej eNOS (Figura 5, dół). Ostatnio wykazano, że skrajny koniec C SR-BI zawiera domenę oddziałującą z PDZ, która jest niezbędna do wiązania się z białkiem PDZK1 zawierającym domenę PDZ (24). Mutant receptora pozbawionego ostatniego aminokwasu (SR-BI A 509) zastosowano do testowania roli domeny wiążącej PDZK1 (24). W przeciwieństwie do receptora typu dzikiego, SR-BI a 509 nie powodowało fosforylacji lub aktywacji eNOS. Dodatkowe eksperymenty wykazały, że lokalizacja eNOS w kaweolach nie została zmieniona przez SR-BI, SR-BII lub SR-BI. 509 (dane nie pokazane). Figura 5SR-BI C-końcowa domena cytoplazmatyczna jest wymagana do fosforylacji i aktywacji eNOS. Komórki COS-M6 transfekowano cDNA eNOS i cDNA SR-BI, SR-BII lub SR-BI-509 dzikiego typu. W celu detekcji fosforylacji eNOS (na górze), 24 godziny po transfekcji, komórki głodzono w pozbawionym surowicy DMEM przez kolejne 24 godziny, komórki inkubowano z HDL (50 .g / ml) przez 0. 10 minut i lizaty komórkowe były analizowano techniką Western blot stosując przeciwciało specyficzne wobec anty-fosfo-eNOS (specyficzne dla Ser1179) (peNOS), przeciwciało monoklonalne anty-eNOS (eNOS) i anty-SR-BI (domena zewnątrzkomórkowa) po [więcej w: zss kolbuszowa dolna, narodowy fundusz zdrowia w łodzi, przychodnia ożarów mazowiecki ] [patrz też: polskie towarzystwo ultrasonograficzne, stężenie alkoholu we krwi kalkulator, kalendarz triathlon 2015 ]