Wiązanie cholesterolu, wypływ i domena oddziałująca z PDZ receptora zmiatającego BI pośredniczy w sygnalizacji inicjowanej przez HDL czesc 4

Do wykrywania aktywacji eNOS (na dole) stosowano równoległe zestawy transfekowanych komórek i mierzono konwersję [3H] L-argininy do [3H] L-cytruliny podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym lub HDL (50 ug / ml ). Wartości (średnia . SEM) wyrażono jako procent aktywności stymulowanej HDL powyżej podstawowej aktywności; n = 4. * P <0,05 versus SR-BI typu dzikiego. C-terminalna domena transbłonowa SR-BI i sygnalizacja HDL. Aby określić, czy inne domeny SR-BI oprócz C-końcowej domeny cytoplazmatycznej są wymagane do sygnalizowania HDL, badaliśmy chimerę SR-BI i CD36 w komórkach COS-M6 eksprymujących eNOS. W jednej chimery składającej się głównie z sekwencji CD36, C-końcowa cytoplazmatyczna domena SR-BI dodana do C-końca CD36 (CD / SRCT, Figura 6). Druga chimera składająca się głównie z CD36 zawierała C-końcową domenę transbłonową i cytoplazmatyczną SR-BI (CD / SRCTMT; Figura 6). Zgodnie z oczekiwaniami w oparciu o wyniki przedstawione na Figurze 4A, SR-BI typu dzikiego spowodował fosforylację i aktywację eNOS w odpowiedzi na HDL, a CD36 typu dzikiego nie (Figura 7A). Chociaż zawiera domenę oddziałującą SR-BI PDZ niezbędną do aktywacji eNOS (Figura 5), CD / SRCT nie spowodowało fosforylacji lub aktywacji eNOS, co wskazuje na wymóg dla innych domen SR-BI. Nieoczekiwanie, dodanie C-końcowej domeny transbłonowej do CD / SRCT w chimery oznaczonej jako CD / SRCTMT dało fosforylację i aktywację eNOS porównywalną do fosforylacji typu dzikiego SR-BI. Ekspresja na powierzchni komórki zarówno CD / SRCT, jak i CD / SRCTMT była porównywalna do ekspresji SR-BI i CD36, a ich zdolność do wywoływania wypływu cholesterolu naśladowała CD36 (dane nie pokazane). Figura 6 Schemat chemiczny receptorów SR-BI, CD36 i chimerycznych. Sekwencja pochodna SR-BIa jest pokazana na szaro, a sekwencja pochodna CD36a jest pokazana na czarno. Figura 7SR-BI C-końcowa domena cytoplazmatyczna nie jest wystarczająca do aktywacji eNOS i wymagana jest również C-końcowa domena transbłonowa, która wiąże cholesterol. (A) Komórki COS-M6 transfekowano cDNA eNOS i cDNA typu dzikiego typu SR-BI, CD36, CD / SRCT lub CD / SRCTMT. W celu detekcji fosforylacji eNOS (na górze), 24 godziny po transfekcji, komórki głodzono w pozbawionym surowicy DMEM przez kolejne 24 godziny i inkubowano z HDL (50 .g / ml) przez 0 lub 10 minut, a lizaty komórkowe analizowano przez Western blotting przy użyciu przeciwciała specyficznego wobec anty-fosfo-eNOSy (specyficznego dla Ser1179) i przeciwciała monoklonalnego anty-eNOS. Do wykrywania aktywacji eNOS (na dole) stosowano równoległe zestawy transfekowanych komórek i mierzono konwersję [3H] L-argininy do [3H] L-cytruliny podczas 15-minutowych inkubacji z buforem kontrolnym lub HDL (50 ug / ml ). Wartości (średnia . SEM) wyrażono jako procent aktywności stymulowanej HDL powyżej podstawowej aktywności; n = 4. * P <0,05 versus SR-BI typu dzikiego. (B) Komórki HEK 293 transfekowano i znakowano [3H] fotocholesterolem; receptory immunoprecypitowano przeciwciałem do C-końcowego ogonka SR-BI; a fotocholesterol [3H] związany z receptorem oceniano za pomocą autoradiografii (u góry). Objętość immunoprecypitowanego receptora oceniano metodą Western blotting (na dole) i obliczono względną ilość receptora związanego [3H] z fotocholesterolem w stosunku do receptora całkowitego. Nasze dane wskazują, że C-końcowa domena oddziałująca PDZ z SR-BI jest niezbędna do przekazywania sygnałów do aktywacji eNOS w odpowiedzi na wypływ cholesterolu z błony komórkowej (Figura 5). Ponadto C-końcowa domena transbłonowa SR-BI jest również wymagana dla tej funkcji (Figura 7A). Na podstawie wcześniejszych prac wskazujących, że wykrywanie steroli przez reduktazę HMG-CoA, białko aktywujące cięcie SREBP (SCAP) i Niemann-Picka C1 (NPC1) pociąga za sobą wiązanie cholesterolu do domen transbłonowych w obrębie tych białek (25. 29), postawiono hipotezę że C-końcowa domena transbłonowa SR-BI wiąże cholesterol. Zdolność pełnej długości SR-b1 typu dzikiego w porównaniu do CD / SRCT do wiązania cholesterolu badano w komórkach HEK 293 wyrażających receptory, które znakowano fotoaktywowanym, sieciowalnym analogiem [3H] 6-fotocholesterolu. Podobne strategie zastosowano ostatnio w celu wykazania bezpośredniego wiązania cholesterolu z SCAP (30). Komórki poddawano promieniowaniu UV, SR-BI lub CD / SRCT poddawano immunoprecypitacji, fotocholesterol związany był oceniany przez autoradiografię (Figura 7B, góra), a obfitość immunoprecypitowanego receptora określano za pomocą analizy immunoblot (Figura 7B, dół). SR-BI był usieciowany do fotocholesterolu, podczas gdy CD / SRCT nie. Aby ustalić, czy C-końcowa domena transbłonowa SR-BI jest odpowiedzialna za wiązanie cholesterolu, przeprowadziliśmy porównywalne badania wiązania fotocholesterolu z CD / SRCTMT [patrz też: kolbuszowa dolna, mleko z biedronki wycofane, badanie kału na pasożyty ] [więcej w: krem pod oczy z peptydami, sok z buraka właściwości, redukcja tkanki tłuszczowej dieta ]